胡秀秀
- 作品数：13 被引量：13H指数：3
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- Ad-NLS-RARα对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制被引量：1
- 2013年
- 目的将已构建验证成功的重组腺病毒Ad—NL＆RARα感染至HL-60细胞中，探讨其对HL-60细胞增殖及全反式维甲酸（ATRA）诱导的HL-60细胞分化的影响及机制。方法将验证正确的腺病毒经Protaminesulfate辅助感染Hl-60细胞，检测感染效率，用RT-PCR和Westernblot检测目的基因在HL-60细胞中的表达情况。MTT法检测细胞增殖情况。病毒感染HL-60细胞24h后，用2．5μmol／LATRA处理，流式细胞术（FCM）检测细胞表面分化抗原CDllb的表达。RT—PCR和Western blot检测GMYC基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果在Protamine sulfate辅助感染作用下，重组腺病毒Ad—NLS-RARα和阴性对照腺病毒Ad—KZ对HL-60细胞的感染效率可达70％～80％。NL＆RARα基因的RT—PCR和Westernblot结果显示，感染了重组腺病毒Ad—NL＆RAR口的HL-60细胞的NLS-RAR口基因的mRNA及蛋白表达水平明显增高（P〈0．05）。MTT法检测表明感染了重组腺病毒Ad-NLS-RARα的细胞增殖能力增高（P〈O．05）。FCM检测结果显示，经ATRA处理后，感染Ad—NLS-RAR口重组腺病毒的HL-60细胞，CDllb表达较阴性对照组和未感染组下调（P〈O．05）。C-MYC基因的RT—PCR和Westernblot检测结果表明，经ATRA处理后，感染Ad—NLS-RARα重组腺病毒的细胞C—MYC基因的mRNA和蛋白水平均高于其他两组（P〈0．05）。结论重组腺病毒Ad—NL-SRARα可以促进HL-60细胞的增殖，并通过上调GMYC基因的表达，抑制ATRA诱导的HL-60细胞分化。
- 胡秀秀刘北忠钟梁高远梅张曦吴秀娟王慧朱新瑜
- 关键词：重组腺病毒HL-60细胞细胞分化
- 重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定
- 2013年
- 目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。
- 高远梅刘北忠张曦胡秀秀钟梁
- 关键词：重组腺病毒K562细胞细胞增殖
- 重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达
- 2013年
- 目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。
- 胡秀秀刘北忠钟梁高远梅张曦吴秀娟王慧朱新瑜
- 关键词：腺病毒K562细胞基因表达
- NLS-RARα基因对HL-60细胞增殖及ATRA诱导的HL-60细胞分化的影响及其机制的研究
- 第一部分重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达 目的:应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα，并检测其在K562细胞中的表达情况。 方...
- 胡秀秀
- 关键词：细胞增殖细胞分化重组腺病毒
- 人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。
- 张曦刘北忠钟梁高远梅胡秀秀王慧马鹏鹏朱新瑜
- 关键词：腺病毒HL60细胞基因表达
- 干扰GINS2表达对HL60细胞增殖和凋亡的影响被引量：6
- 2013年
- 目的:探讨靶向抑制GINS2基因表达后对人早幼粒细胞白血病细胞株HL60增殖和凋亡的影响及其机制。方法:RT-PCR分别检测GINS2基因在三株白血病细胞HL60、U937、THP-1的表达。设计与合成针对GINS2基因的干扰序列,稳定转染高表达该基因的HL60细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况;RT-PCR和Western blot分别检测各组细胞转染后mRNA和蛋白质水平;MTT法检细胞的增殖和凋亡情况;流式细胞术分析细胞的凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果:在三株白血病细胞株中,GINS2的表达量由低到高依次是:THP-1,U937,HL60。干扰质粒转染HL60细胞后,与阴性对照组及未处理组相比,干扰组GINS2的mRNA和蛋白质水平均显著降低,且细胞的增殖能力明显受抑。同时,凋亡相关蛋白Bax表达水平显著增高而Bcl2显著降低。结论:干扰GINS2基因表达后,其mRNA和蛋白质水平均显著降低,可通过上调Bax表达,下调Bcl2表达来抑制HL60细胞增殖并促进其凋亡。
- 张曦刘北忠高艳军黎亮高远梅胡秀秀马鹏鹏钟梁
- 关键词：细胞凋亡HL60细胞BAXBCL2
- GINS2基因siRNA真核表达质粒的构建及其对NB4细胞凋亡的影响被引量：3
- 2012年
- 目的构建GINS2基因siRNA真核表达质粒,并检测其对NB4细胞凋亡的影响。方法人工合成针对GINS2基因的4组siRNA干扰序列和1组无同源性的序列,测序鉴定后转染低传代人早幼粒细胞系NB4细胞,经G418筛选后,通过QRT-PCR、Western blot检测重组质粒对NB4细胞中GINS2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的影响;流式细胞术检测NB4细胞的凋亡情况。结果 5组重组质粒经测序证明构建正确,4组干扰质粒转染NB4细胞后,细胞中GINS2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均有所降低,其中干扰组1基因干扰率达50%,蛋白相对表达量为56%;干扰组1细胞凋亡率为32.54%,较正常对照组和NC组明显上升(P<0.01)。结论成功构建了GINS2基因siRNA真核表达质粒,抑制GINS2基因的表达可促进NB4细胞的凋亡,为进一步研究GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。
- 高艳军刘北忠钟梁初晨吴秀娟黎亮张曦高远梅胡秀秀
- 关键词：RNA干扰NB4细胞细胞凋亡
- 下调GINS2表达抑制HL60细胞周期调控因子被引量：6
- 2013年
- 目的观察下调GINS2的表达后对人白血病细胞系HL60周期调控因子的变化并探讨其机制。方法脂质体介导并稳定转染干扰质粒的细胞为干扰组,转染阴性对照质粒的细胞为阴性对照组,只加入脂质体的细胞为空白对照组,未转染的HL60细胞为未处理组。集落形成实验测定细胞增殖;流式细胞术分析细胞周期;3H-TdR掺入实验检测细胞DNA合成;Western blot检测CDK1、cyclinB1等蛋白;RT-PCR检测ATM,CHK2,P53等mRNA水平;Western blot检测其蛋白水平。结果和其他3组相比,干扰组细胞G2期细胞数明显增加、DNA合成受阻、增殖减慢。与G2期相关周期调控蛋白CDK1,cyclinB1的表达随时间变化而明显降低。和其他3组相比,干扰组细胞ATM,CHK2,P53转录水平和翻译水平显著上调。结论下调GINS2表达后可抑制HL60细胞DNA复制并影响其G期进程,机制可能与ATM,CHK2,P53等基因相关。
- 张曦钟梁高远梅胡秀秀王慧朱新瑜刘北忠
- 关键词：HL60细胞G2期阻滞
- 腺病毒介导的PML(NLS^-)对大黄素引起的HL-60细胞存活的影响及其机制被引量：1
- 2013年
- 目的探讨PML(NLS-)对大黄素引起的人HL-60细胞凋亡的影响及其机制。方法将构建成功的重组腺病毒Ad-PML(NLS-)和空载病毒Ad-KZ分别感染HL-60细胞,并设空白对照组。RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞PML(NLS-)基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法分析腺病毒感染各组经60μmol/L大黄素处理后的细胞的增殖能力;各组感染HL-60细胞经60μmol/L大黄素处理后,FCM法分析细胞周期分布和凋亡率;并用RT-PCR法和Western blot法分别检测各组细胞凋亡相关基因C-MYC、BCL-2和BAX的mRNA及蛋白表达水平。结果与空白对照组和空载病毒组比较,RT-PCR和Western blot结果显示,AdPML(NLS-)组细胞内的PML(NLS-)表达水平明显增高。各组细胞经大黄素处理后,MTT结果显示,感染AdPML(NLS-)的HL-60细胞增殖能力明显提高;FCM结果显示,感染Ad-PML(NLS-)的HL-60细胞处于G1期细胞比例降低,S期细胞比例增高(P<0.05),且凋亡率降低(P<0.05);细胞内BCL-2和C-MYC基因mRNA的转录和蛋白表达水平增高,BAX基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平均下降。结论过表达PML(NLS-)基因能够促进经过60μmol/L大黄素处理的HL-60细胞的增殖,可能通过上调BCL-2和C-MYC基因的表达、下调BAX基因的表达抑制细胞凋亡。
- 高远梅刘北忠张曦胡秀秀钟梁
- 关键词：白血病HL-60细胞
- 中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对U937细胞增殖和凋亡的影响被引量：3
- 2013年
- 目的比较两种中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制剂GW311616A和西维来司钠（sive—lestat）对U937细胞增殖和调亡的影响。方法采用四唑蓝比色试验（MTT）检测细胞增殖抑制率；用透射电镜观察细胞形态学变化；用流式细胞术检测细胞凋亡[膜联蛋白V／碘化丙锭（AnnexinV／PI）双标记法]及细胞周期变化；应用间接免疫荧光法观察细胞内NE表达水平；同时利用ELISA法和比色法检测细胞内NE含量和活性的变化。使用SPSS13．0软件对所得数据进行统计分析，采用完全随机设计资料的方差分析和Dunnett—t检验对各处理组数据进行比较。结果MTr法检测结果显示两种药物均能抑制U937细胞的增殖，且具有一定的剂量依赖效应，GW311616A和西维来司钠的Ic50值分别为150、214μmol／L。GW311616A对U937细胞的增殖抑制作用高于西维来司钠（P〈0．01）；电镜结果显示两种药物处理的U937细胞均能看到典型的细胞凋亡形态；AnnexinV／PI双标记法结果表明两种药物均能引起U937细胞的早期凋亡，GW311616A（150μmol／L）组的凋亡率为13．60％，西维来司钠组（150μmol／L）为3．69％，GW311616A对其凋亡的影响比西维来司钠更明显（P〈0．01）；流式细胞术检测结果显示GW311616A（150μmol／L）组的凋亡率为14．61％，细胞周期主要阻滞于G2／M期，西维来司钠（150μmol／L）组的凋亡率为4．25％，细胞周期主要阻滞于S期；间接免疫荧光法检测结果显示GW311616A组荧光强度明显减弱，而西维来司钠组荧光强度未明显减弱；ELISA和比色法结果显示两种药物均能使U937细胞内NE含量和活性降低，但GW311616A对他们的影响大于西维来司钠（P〈0．01）。结论GW311616A和西维来司钠均能抑制U937细胞的增殖，引起其凋亡，但前者比后者更有效，更能造成细胞的损伤。
- 马鹏鹏朱丹刘北忠钟梁朱新瑜王慧张曦高远梅胡秀秀
- 关键词：弹性蛋白酶抑制剂U937细胞细胞凋亡
