傅煜轩
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
- 供职机构：南京医科大学基础医学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 羟喜树碱通过蛋白激酶R样内质网激酶途径促进人Tenon囊成纤维细胞自噬作用被引量：3
- 2015年
- 背景 研究证实,羟喜树碱可通过蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径引起人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）凋亡,细胞自噬与凋亡均为细胞在外界压力下产生的程序性死亡反应,二者关系密切,但羟喜树碱与HTFs自噬之间的关系尚不明确. 目的 探讨羟喜树碱对HTFs自噬的作用及其机制.方法 从健康成年眼球供体中取人Tenon囊组织,经组织块培养法培养细胞,并用免疫组织化学法检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定培养的细胞.利用293T细胞包装pLVX-PERK慢病毒,将慢病毒转染入HTFs,通过嘌呤霉素筛选出稳定的PERK敲除细胞系.用质量浓度为0.10 g/L的羟喜树碱处理细胞5 min后继续培养24h作为实验组,未用羟喜树碱处理的细胞作为对照组.采用Western blot法检测各组HTFs中自噬相关蛋白Beclin-1、自噬相关基因5（ATG-5）、微管相关蛋白1轻链3（LC-3）表达的灰度值;采用Cyto-ID荧光染色法检测各组HTFs中自噬小体的荧光强度及数量,将各实验结果进行分析比较. 结果 0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中Beclin-1、ATG-5、LC-3-Ⅰ和LC-3-Ⅱ蛋白表达的灰度值分别为0.980±0.070、1.495±0.095、0.585±0.025和0.785±0.055,明显高于对照组的0.365 ±0.045、0.765 ±0.055、0.120±0.030和0.215±0.035,差异均有统计学意义（Beclin-1：P=0.018;ATG-5：P=0.022;LC-3-Ⅰ：P=0.007;LC-3-Ⅱ：P=0.013）.荧光显微镜检测发现,羟喜树碱处理组中自噬小体的绿色荧光强于对照组.Western blot检测结果显示,PERK敲除的细胞中PERK蛋白灰度值为0.130±0.030,明显低于对照组的0.765 ±0.055,差异有统计学意义（P=0.010）,而2个组间细胞中Beclin-1、ATG-5和LC-3蛋白反应条带强度无明显差别.0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中PERK蛋白表达的灰度值为1.790±0.060,较对照组的0.880±0.070明显升高,差异有统计学意义（P=0.010）.PERK敲除±0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中Beclin-1、ATG-5、LC-3-Ⅰ和LC-3-Ⅱ蛋白�
- 范舒欣傅煜轩袁志兰
- 关键词：自噬羟喜树碱内质网应激TENON囊基因转染基因敲除
- 羟基喜树碱联合依托泊苷对人Tenon囊成纤维细胞凋亡的影响及其机制被引量：1
- 2014年
- 背景研究表明，羟基喜树碱（HCPT）和依托泊苷（VP-16）均能诱导人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的凋亡，但这两种药物联合应用对体外培养的HTFs是否有协同作用尚不明确。目的观察HCPT与VP-16联合应用后在促进体外培养的HTFs凋亡方面是否有协同性，并探讨其作用机制。方法人眼Tenon囊成纤维组织取自江苏省人民医院眼库，采用组织块培养法培养和传代HTFs，采用免疫组织化学法检测HTFs中波形蛋白的表达。第4代HTFs接种于96孔板，分别将不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg／L）、VP-16（0．6、2．5、5．0、25．0、50．0mg／L）、HCPT＋VP-16（质量比为2：1，终质量浓度分别为0．80、3．75、7．50、37．50、75．00mg／L）加入细胞培养孔处理24h，用CCK-8法检测各组药物对细胞增生的抑制率。将HTFs分为空白对照组、HCPT（50mg／L）处理组、VP-16（25mg／L）处理组、HCPT＋VP-16（37．5mg／L）处理组，药物处理24h后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白，采用Westernblot法检测各药物处理组细胞内caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt的表达水平。结果培养的细胞呈多边形或不规则形，波形蛋白表达阳性。不同质量浓度HCPT、VP-16和HCPT＋VP-16作用24h后，随着药物质量浓度的增加，对HTFs增生的抑制率增加，差异均有统计学意义（HCPT：F=41．34，P=0．00；VP-16：F=62．60，P=0．00；HCPT＋VP-16：F=46．77，P=0．00），HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组药物的半数抑制浓度（IC50）分别为80．99、27．93、19．81mg／L，HCPT与VP-16联合应用的合并指数（cI）为0．399，表明VP-16和HCPT具有强协同作用。空白对照组、HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs的凋亡率分别为（4．87±0．78）％、（11．20±1．94）％、（12．67±1．51）％和（19．77±2．01）％，�
- 于东毅傅煜轩姚志峰袁志兰
- 关键词：羟基喜树碱依托泊苷凋亡细胞培养
- 羟喜树碱诱导的人Tenon囊成纤维细胞凋亡及其机制被引量：2
- 2013年
- 背景青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）增生是滤过泡功能下降的主要原因，羟喜树碱是诱导肿瘤细胞及多种非肿瘤细胞凋亡的药物。目前已有羟喜树碱诱导成纤维细胞凋亡的相关报道，但其作用机制尚不完全清楚。目的探讨羟喜树碱是否能诱导HTFs凋亡并研究其作用机制。方法取离体〈6h的供体结膜囊组织，以组织块培养法原代培养HTFs，用含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养基继续传代培养，用波形蛋白及角蛋白对培养的细胞进行鉴定，取3～6代细胞进行实验。分别将0．Ol、0．05、0．10g／L羟喜树碱加入培养基中作用5min，未加入羟喜树碱的细胞作为对照组，采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）法检测各组细胞的增生能力并进行比较。用0．10g／L羟喜树碱处理细胞，继续培养24h，用annexinV／PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，用JC-1染色检测HTFs线粒体膜电位，采用Westernblot法检测HTFs中半胱氨酸天冬酶-3（caspase-3）、easpase-9及线粒体／细胞质中细胞色素C（cytC）蛋白的表达，对各组中的测量结果进行比较。结果0、0．01、0．05、0．10g／L羟喜树碱组的HTFs增生值（A450）分别为0．9716±0．0608、0．8035±0．0346、0．7048±0．0446和0．6265±0．0286，总体差异有统计学意义（F=26．372，P=0．002），0．01、0．05、0．10g／L羟喜树碱组HTFsA450值均低于对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05），以0．10g／L羟喜树碱组HTFsA。，。值最低。AnnexinV／PI双染色检测发现，0．10g／L羟喜树碱组HTFs凋亡率为（18．72±1．41）％，明显高于对照组的（3．67±O．36）％，差异有统计学意义（t=-10．374，P=0．001）；0．10g／L羟喜树碱组HTFs中caspase-3、caspase-9蛋白的表达强度明显强于对照组。JC-1染色发现，0．10g／L羟喜树碱处理5min后细胞质中单体JC．1的绿色荧光明显强于对照�
- 殷雪傅煜轩袁志兰
- 关键词：羟喜树碱成纤维细胞线粒体凋亡途径青光眼
- MicroRNA--200b调控细胞周期蛋白p27进而促进结肠癌增殖的机制
- 傅煜轩
