丁久元
- 作品数：40 被引量：82H指数：6
- 供职机构：中国科学院微生物研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国科学院重点实验室基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程轻工技术与工程医药卫生更多>>
- 带有sop基因稳定表达载体的构建
- 1996年
- F质粒的第五个EcoRⅠ片段mini-F具有质粒的分配功能。其EcoRⅠ-BamHⅠ片段含有oriS、ccd、repD和sop基因(sopA,B和C)。该片段与pBR322重组,得到质粒pDMC32。pDMC32经SmaⅠ酶切,T4连接酶连接,得到衍生质粒pDMC311,消除了oriS、ccd和repD片段。MI32(pDMC32)和MI311(pDMC311),在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率分别为93％和100％。而对照MIR322(pBR322)培养55代时,质粒保持率仅为10％。带有色氨酸启动子质粒pDR720与pBR322重组,得到质粒pDMC40。pDMC40再与mini-F的sop基因重组,得到带有sop基因的稳定表达质粒pDMC48。MI48(pDMC48)在液体限磷基础培养基中培养100代,质粒保持率为100％。
- 杜笑寒丁久元吴夏英余志华门大鹏
- 关键词：基因载体
- L-苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用
- 本发明公开了一种L‑苏氨酸转运蛋白ThrF及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为ThrF蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基...
- 丁久元张英姿王宇赵智
- 源自谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用
- 本发明公开了一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且...
- 丁久元刘桂明李开赵智王宇张英姿
- L-精氨酸发酵过程动力学特性的分析研究(摘要)
- 龚建华丁久元黄和客
- 关键词：精氨酸发酵动力学分析菌株
- 北京棒杆菌转酮酶:基因克隆、序列分析与表达被引量：3
- 2010年
- 【目的】转酮酶是非氧化磷酸戊糖途径中的关键酶。从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense PD-67)中克隆转酮酶(transketolase,EC2.2.1.1,TK)基因,并将转酮酶基因在C.pekinense PD-67中进行表达,研究增加转酮酶活性对C.pekinense PD-67生理特性的影响。【方法】分别以C.pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增tkt的全基因序列和前端控制序列;通过pAK6载体提高tkt基因在C.pekinense PD-67中的拷贝数,从而提高C.pekinense PD-67中转酮酶的活性。【结果】tkt基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与结构分析结果表明,C.pekinense突变株PD-67与野生株AS1.299相比较,二者调控序列及结构基因核苷酸序列完全一致。与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比较,突变株PD-67的氨基酸序列有5个氨基酸差异,其中4个位于与辅因子硫胺素焦磷酸结合的结构域内。突变株PD-67来源的tkt基因在北京棒杆菌PD-67中得到了表达,重组菌转酮酶比活力比对照菌株提高了2倍。C.pekinense PD-67(pTK3)与对照菌株PD-67(pAK6)相比,生长加快,L-色氨酸的最终积累量也较高。【结论】本工作从C.pekinense1.299和PD-67中克隆到tkt基因,并实现tkt基因的同源表达。适当提高菌株转酮酶活力,有助于菌体生长和色氨酸积累。
- 季维克赵智张英姿王宇丁久元
- 关键词：北京棒杆菌L-色氨酸
- 一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因与应用
- 本发明公开了一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，名称为GabP，其编码基因为GabP，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨...
- 丁久元赵智刘双江马温华
- 北京棒杆菌DAHP合成酶Ⅰ基因的克隆﹑序列分析及表达被引量：7
- 2008年
- 【目的】从北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中克隆DAHP合成酶(EC2.5.1.54,3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,DS)Ⅰ基因,对其进行功能验证;并将DAHP合成酶Ⅰ基因在C.pekinensePD-67进行同源表达,研究该酶的比活力与生长的相关性。【方法】分别以C.pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了DAHP合成酶Ⅰ的全基因序列aroⅠ和前端控制序列;通过pAK6载体提高DAHP合成酶Ⅰ基因在C.pekinensePD-67中的拷贝数实现其同源表达。【结果】核苷酸序列分析结果表明,C.pekinense野生株AS1.299与突变株PD-67相比较,DAHP合成酶Ⅰ基因序列完全一样;通过PCR方法得到的DAHP合成酶Ⅰ基因结构功能完整,能与DAHP合成酶完全缺陷的E.coli3257实现异源互补。突变株PD-67来源的DAHP合成酶Ⅰ基因在重组菌PD-67(pAD1)中进行了表达,在稳定期初期重组菌PD-67(pAD1)的DAHP合成酶Ⅰ的酶比活力比同期的对照菌株PD-67(pAK6)中的该酶酶比活力提高了约5倍。【结论】本工作首次证实了C.pekinense1.299和PD-67中存在DAHP合成酶Ⅰ基因,异源互补试验证明扩增得到的DNA片段编码DAHP合成酶Ⅰ,酶学性质研究表明DAHP合成酶Ⅰ基因在C.pekinensePD-67中的同源表达将有助于提高该菌的色氨酸积累。
- 张春花赵智张英姿王宇丁久元
- 关键词：北京棒杆菌L-色氨酸
- 一种来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用
- 本发明公开了一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且...
- 丁久元刘桂明李开赵智王宇张英姿
- 过表达pps基因和aroG^(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响被引量：1
- 2014年
- 【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。
- 臧传刚赵智王宇张英姿丁久元
- 关键词：北京棒杆菌过表达L-色氨酸
- 罗氏真养菌W50的D-木糖代谢途径工程改造被引量：2
- 2014年
- 【目的】拓宽高产聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50的碳源使用范围,使其获得D-木糖代谢能力。【方法】运用PCR技术扩增大肠杆菌(Escherichia coli)K-12W3110来源的D-木糖转运蛋白基因xylE,利用同源重组技术将xylE基因整合到R.eutropha W50的染色体上构建菌株W50-E。运用PCR技术扩增E.coli K-12 W3110来源的D-木糖代谢基因xylAB和R.eutropha H16来源的PHA合酶基因phaC1的启动子片段P pha C1,同表达载体连接后构建重组质粒p1-AB。将重组质粒分别转入菌株R.eutropha W50和W50-E中构建工程菌株W50-AB和W50-EAB。通过摇瓶发酵研究W50-AB和W50-EAB的D-木糖代谢特性。【结果】酶活分析结果表明,xylA和xylB基因在菌株R.eutropha W50中得到表达。摇瓶发酵结果表明,W50-AB在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中的最大比生长速率为0.025 h-1,在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中没有生长;W50-EAB在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中表现出一定生长,在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中最大比生长速率为0.035 h-1。PHB含量分析结果表明,摇瓶发酵终点时,W50-AB和W50-EAB菌株内的PHB含量分别为细胞干重的15.07±1.01%和15.07±1.64%,其相应的D-木糖-PHB转化率分别为0.0920 g·g-1和0.0838 g·g-1,低于两重组菌株利用葡萄糖发酵的糖-PHB转化率(>0.22 g·g-1)。另外,重组菌株W50-AB和W50-EAB在含葡萄糖(0.01 mol/L)和D-木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养基中的发酵结果表明,两重组菌株均表现出更高的生长速率和D-木糖消耗速率以及胞内PHB积累量。【结论】来源于E.coli K-12W3110菌株的xylAB基因的表达使R.eutropha W50获得了一定的D-木糖代谢能力,通过D-木糖转运蛋白基因xylE的表达能提高菌株的D-木糖代谢能力,同时重组菌株利用D-木糖能积累一定量PHB。
- 刘凯刘桂明张英姿丁久元翁维琦
