初晨
- 作品数：5 被引量：5H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学附属永川医院更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- BPHL与PML-C间相互作用的胞内、外验证
- 2013年
- 目的通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术验证人联苯样水解酶(BPHL)与缺失核定位信号的人急性早幼粒细胞白血病(PML)基因的coiled-coil的结构域(PML-C)蛋白之间的相互作用。方法将表达PML-C诱饵蛋白及BPHL靶蛋白的重组质粒pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交实验验证两者在活细胞内的相互作用。构建能在人胚肾293细胞中表达带HA标签的PML-C融合蛋白的重组载体pCMV-HA-PML-C,经酶切鉴定正确后,和表达带myc标签的BPHL融合蛋白的重组真核表达载体pCMV-myc-BPHL,共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证BPHL与PML-C间的相互作用。结果 pGBKT7-PML-C及pACT2-BPHL质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆。构建的重组表达载体pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL经双酶切鉴定正确后共转染HEK293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀HA-PML-C相互作用蛋白复合物后,用抗c-myc单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到myc-BPHL的表达蛋白。结论成功构建了pCMV-HA-PML-C及pCMV-myc-BPHL融合蛋白真核表达重组载体,利用酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术证实BPHL与PML-C之间存在着相互作用。
- 初晨刘北忠钟梁吴秀娟朱丹吴燕
- 关键词：蛋白质相互作用酵母双杂交
- PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证
- 2012年
- 目的验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域（PML—C）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用。方法构建分别表达诱饵蛋白PML—C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9，然后转人酵母AH109，培养3～5d后对其是否有胞内相互作用进行检测。将目的片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV—HA和pCMV—myc里，然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293），最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果在共转化了质粒pGBKT7-PML—C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长。用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀，再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹，最终检测出融合蛋白myc—RANBP9条带。结论酵母双杂交实验验证了PML—C和RANBP9之间存在胞内相互作用，同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用。
- 黎亮刘北忠钟梁朱丹王翀高艳军吴秀娟初晨
- 关键词：白血病蛋白质相互作用酵母双杂交系统免疫共沉淀
- 含Coiled-coil结构的PML结构域与CNPY2蛋白相互作用的胞内外验证被引量：2
- 2012年
- 目的通过胞内外试验验证含Coiled-coil结构的PML结构域(PML-C)与CNPY2蛋白的相互作用。方法将质粒pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C共转化入酵母菌AH109,通过酵母双杂交技术检测CNPY2蛋白和PML-C在AH109细胞内的相互作用;构建重组质粒pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-CNPY2,共转染HEK293细胞,采用Western blot法检测细胞中CNPY2蛋白的表达;免疫共沉淀技术从胞外验证两种蛋白的相互作用。结果 pACT2-CNPY2和pGBKT7-PML-C质粒共转化入AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;重组质粒pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-CNPY2共转染的HEK293细胞的全细胞裂解液可与鼠抗c-MYC单抗特异性结合;经免疫共沉淀可检测到与PML-C相互作用的蛋白复合体。结论通过酵母双杂交试验和免疫共沉淀技术证实,PML-C与CNPY2蛋白存在相互作用。
- 吴秀娟刘北忠鈡梁初晨朱丹吴燕
- 关键词：酵母双杂交系统免疫共沉淀
- GINS2基因siRNA真核表达质粒的构建及其对NB4细胞凋亡的影响被引量：3
- 2012年
- 目的构建GINS2基因siRNA真核表达质粒,并检测其对NB4细胞凋亡的影响。方法人工合成针对GINS2基因的4组siRNA干扰序列和1组无同源性的序列,测序鉴定后转染低传代人早幼粒细胞系NB4细胞,经G418筛选后,通过QRT-PCR、Western blot检测重组质粒对NB4细胞中GINS2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的影响;流式细胞术检测NB4细胞的凋亡情况。结果 5组重组质粒经测序证明构建正确,4组干扰质粒转染NB4细胞后,细胞中GINS2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均有所降低,其中干扰组1基因干扰率达50%,蛋白相对表达量为56%;干扰组1细胞凋亡率为32.54%,较正常对照组和NC组明显上升(P<0.01)。结论成功构建了GINS2基因siRNA真核表达质粒,抑制GINS2基因的表达可促进NB4细胞的凋亡,为进一步研究GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。
- 高艳军刘北忠钟梁初晨吴秀娟黎亮张曦高远梅胡秀秀
- 关键词：RNA干扰NB4细胞细胞凋亡
- 人联苯样水解酶(BPHL)在急性早幼粒细胞白血病发生中的分子机制研究
- 第一部分: BPHL与PML-C间相互作用的体内、外验证 目的:通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀技术验证BPHL与PML-C蛋白之间的相互作用。 方法:将质粒pACT2-BPHL及pGBKT7-PML-C共同转化AH1...
- 初晨
- 关键词：酵母双杂交免疫共沉淀急性早幼粒细胞白血病
