杨雪芹
- 作品数：15 被引量：47H指数：4
- 供职机构：广州中医药大学青蒿研究中心更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家自然科学基金国家中医药管理局基金资助项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 青蒿素合成cDNA和新EST的克隆及其低温诱导表达的定量分析被引量：3
- 2008年
- 为了开展基于青蒿发育特异及环境诱导转录物组学的新基因分离与鉴定,本研究采集经低温处理的盛花期青蒿(Artemisia annua)叶片提取总RNA,并进行全长cDNA表达序列标签(expres sedsequence tags,EST)克隆,经测序和同源性检索后提交GenBank.在已注册的75个序列中,共有4个全长cDNA与青蒿已知基因高度同源,其余71个EST在青蒿基因中无测序记录,但其中有34个序列与其他植物基因同源,包括24个已知蛋白编码序列和10个未知蛋白编码序列,另外37个序列在任何植物基因中均无测序记录,为首次克隆的植物新基因.为了研究青蒿基因对极端环境胁迫的响应模式,采用半定量PCR(semi-quantitative PCR,SQ-PCR)对冷处理前后青蒿试管苗中青蒿素合成基因ADS,CYP71AV1和CPR的表达水平进行了测定.结果显示,ADS和CYP71AV1基因受冷胁迫强烈诱导,但CPR基因未受明显影响.同时还发现这种冷胁迫诱导作用可被Ca2+通道抑制剂氯化镧(LaCl3)或Ca2+螯合剂EGTA所阻遏,表明Ca2+-CaM信号转导通路可能参与冷胁迫诱导ADS和CYP71AV1基因的表达.对冷胁迫青蒿试管苗的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)测定结果表明,CaM基因的表达水平上调2.5倍,从而印证了上述CaM介导信号转导与冷胁迫诱导基因表达之间相关的推论.利用RFQ-PCR对7个新分离青蒿EST进行了功能注释,结果显示,D/LTSRP,UBE,AR/DAP和POD1基因的冷胁迫诱导表达水平分别上调约8.0,5.0,2.3和1.5倍,而CHI和RGP基因的表达无明显上调或下调.本研究首次在转录水平上对青蒿素合成基因及青蒿新EST的冷胁迫诱导表达模式进行了初步探讨,有助于深入了解青蒿素合成与累积的内在规律及其协同调节机制,为促进青蒿的遗传性状改良及代谢工程指导的育种工作打下基础.
- 曾庆平赵昌尹录录杨瑞仪曾晓梅黄瑛冯丽玲杨雪芹
- 关键词：表达序列标签非生物胁迫荧光定量
- 青蒿紫穗槐二烯合酶基因的克隆与表达被引量：1
- 2008年
- 【目的】重建青蒿素合成代谢途径,以研制青蒿素高产微生物反应器。【方法】以低温预处理青蒿试管苗提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增紫穗槐二烯合酶基因(ADS),并导入大肠杆菌中表达。【结果】青蒿ADScDNA测序结果已在GenBank注册。当ADScDNA与谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)融合并在大肠杆菌表达后,其菌体裂解上清中可检测到谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性,表明ADS基因已有可溶性表达。当裂解上清与法呢基焦磷酸(FDP)保温后,成功地检测到青蒿特有的倍半萜烯。【结论】青蒿ADS基因已在细菌体内实现功能性表达。
- 黄瑛尹录录冯丽玲杨瑞仪杨雪芹曾庆平
- 关键词：基因表达
- 青蒿萜类合成途径的交流模式(英文)被引量：3
- 2010年
- 【目的】探讨青蒿细胞质与质体中的萜类合成途径的相互关系。【方法】用甲羟戊酸(MVA)途径抑制剂洛伐他汀、脱氧木酮糖磷酸(DXP)途径抑制剂磷甘霉素及类固醇合成抑制剂咪康唑对青蒿苗进行处理,对途径终产物——β-胡萝卜素和生育酚的生成以及细胞质内的MVA途径关键酶基因(HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、SQS)和质体内的DXP途径关键酶基因(DXS、DXR)的转录表达水平的动态变化进行了定量依时分析。【结果】洛伐他汀对MVA途径基因(HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、SQS)和DXP途径基因(DXS、DXR)的转录均有抑制作用,但对DXP途经终产物(β-胡萝卜素和生育酚)的合成无显著影响,叶片也并未出现白化。磷甘霉素处理后对DXS、DXR转录和β-胡萝卜素、生育酚合成有持续抑制作用,但MVA途径基因转录在3h瞬时提高,青蒿苗同时出现短根和叶片白化现象。添加咪康唑后青蒿素合成基因(ADS、CYP71AV1、CPR)的转录水平分别提高11、5和3倍。【结论】表明青蒿2条萜类合成途径之间存在物质交流,且流动方向可能以叶绿体向胞浆流动为主,抑制青蒿素合成竞争途径可调节细胞代谢向青蒿素合成方向移动。
- 杨瑞仪杨雪芹冯丽玲曾庆平
- 关键词：甲羟戊酸途径
- 黄花蒿Dbr2基因的分离与诱导表达特性分析
- 2011年
- 目的：从黄花蒿中分离鉴定青蒿素生物合成途径关键酶——青蒿醛双键还原编码基因（Dbr2）并研究其表达特性，藉此探索提高该基因表达量并进一步促进青蒿素合成的途径。方法：采用PCR法从黄花蒿总RNA中分离Dbr2基因编码序列，并采用实时荧光定量PCR法定量检测Dbr2基因在多种人工模拟环境中的转录表达模式。结果：从黄花蒿中分离出1179bp的Dbr2基因编码序列。经过低温、紫外辐射、淹水、脱水、复水、真菌诱激子、葡萄糖、水杨酸处理，Dbr2 mRNA水平分别提高2.5、3.7、10.8、6.0、34.5、28.7、6.3和8.5倍。结论：黄花蒿Dbr2基因可能具有环境诱导表达特性。
- 杨瑞仪杨雪芹冯丽玲曾庆平
- 关键词：黄花蒿青蒿素
- 人RANTES基因在转基因青蒿植株中表达的测定被引量：9
- 2004年
- 目的 为了增强青蒿的特异药理活性,探讨人β-趋化因子RANTES基因在青蒿细胞中表达的可能性。方法 将克隆的RANTES基因经Ti质粒衍生的双元表达载体pROKII导入根癌农杆菌LBA4404菌株,通过叶盘共培养法已获得一批表现卡那霉素抗性的转基因青蒿植株。结果 PCR和Southern印迹杂交分析表明,RANTES基因已导入并整合到青蒿基因组中;RT-PCR、Northern印迹、Western印迹杂交结果证实,RANTES基因已在转基因青蒿植株中成功表达。结论 首次报道了RANTES基因在转基因青蒿植株中的表达,为基因工程改造青蒿打下了良好的基础。
- 冯丽玲曾庆平杨雪芹
- 关键词：青蒿RANTES基因
- 恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因克隆、可溶性表达及突变体活性分析
- 2007年
- 为了建立以代谢酶类为靶点的新型抑制剂乃至抗疟药高通量筛选和体外评价平台,从恶性疟原虫海南株FCC1中扩增出乳酸脱氢酶基因(PfLDH)。利用融合表达载体pGEX-2TK和pET-29a(+)将PfLDH基因导入大肠杆菌BL21和BL21(DE3)中高效表达,结果成功地在菌体裂解上清液中检测到高酶促活性的PfLDH。以pGEX-2TK为载体的PfLDH基因主要以包涵体形式表达,以pET-29a(+)为载体的PfLDH基因则能大量表达可溶性PfLDH,表明后者更适合用来大量制备重组PfLDH。同时,根据SDS-PAGE图谱并结合序列分析结果,对基因扩增中随机产生的PfLDH截短序列进行了筛选和克隆,从中获得4个携带终止突变并分别编码45、80、149和263个氨基酸残基的“提早成熟”基因PfLDH-Δ271、-Δ236、-Δ167和-Δ53。通过基因表达及酶促活性测定,评价了提前终止突变对PfLDH活力的影响,为探讨PfLDH结构与功能的关系提供了依据。
- 徐小玲杨瑞仪杨雪芹冯丽玲曾庆平
- 黄花蒿ADS启动子的分离及表达特性分析被引量：1
- 2011年
- 目的:从黄花蒿中分离鉴定青蒿素生物合成途径关键酶——紫穗槐二烯合酶编码基因(ADS)的启动子序列并研究其表达特性,藉此探索提高该基因表达量并进一步促进青蒿素合成的途径。方法:采用PCR法从黄花蒿DNA中分离ADS 5'端非翻译区(5'UTR)序列,构建与GUS报告基因融合的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草。GUS组织化学染色法和分光光度法分别定性和定量检测ADS 5'UTR序列调控GUS基因在正常条件和胁迫条件下的表达。结果:从黄花蒿中分离出2 448 bp的ADS 5'UTR序列,获得与GUS基因融合表达的转基因烟草并检测到GUS活性。GUS活性定量检测结果显示,在4℃和紫外辐射条件下,转化烟草GUS活性分别提高1.6,2.2倍。结论:从黄花蒿分离出的ADS 5'UTR序列具有启动子功能并且可能具有环境诱导表达特性。
- 杨瑞仪杨雪芹冯丽玲曾庆平
- 关键词：黄花蒿ADS启动子青蒿素
- 大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型被引量：1
- 2005年
- 目的为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA,经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROK,并导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘,在添加25μg/mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500μg/mL5-氟胞嘧啶(5-FC)和25μg/mLKan的MS培养基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡,而未转化青蒿芽仍正常生长,表明导入CodA基因的青蒿细胞已赋予其预期的负选择表型。经RT-PCR检测,转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带,而未转化青蒿芽无此特异扩增带。这一结果显示,CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA,从而进一步印证了表型检测结果。结论CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。
- 冯丽玲杨瑞仪杨雪芹曾庆平
- 关键词：青蒿基因打靶负选择
- 套式PCR检测试剂盒用于普查疟疾带虫率的评价(英文)被引量：2
- 2013年
- 【目的】评价套式PCR检测试剂盒在疟疾现场监测中的效果。【方法】对疟疾从高度流行区转入低度流行区的非洲科摩罗Moheli岛居民,采集其指血2 098人份,同时制作厚血片和抗凝血样,用自制的套式PCR检测试剂盒检测所采集血样中的疟原虫,并与镜检法进行比较。为了避免假阳性,试验中设置了阴性对照组和阳性对照组。【结果】2 098份血样中,套式PCR技术阳性数140人,阳性率为6.67%;镜检阳性数63人,阳性率为3.00%。【结论】套式PCR检测试剂盒检测疟疾感染具高度敏感性,在疟疾控制转入清除阶段,采用此法普查可发现低密度疟原虫携带者,对快速清除传染源将有重要价值。
- 李国铭周耀芳邓常生杨雪芹罗晓莉陈颖婷杨瑞仪曾庆平李国桥冯丽玲
- 青蒿鲨烯合酶基因打靶研究被引量：3
- 2006年
- 目的通过代谢途径工程调整代谢流向,试图增大转基因青蒿Artemisia annua植株中的青蒿素产量。方法利用青蒿鲨烯合酶(SS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载体,并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens。以叶盘法转化青蒿,采用"分段选择法"筛选转基因再生植株。结果对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株,采用PCR及PCR产物杂交法,在1棵转基因植株中检测到外源GFP基因,而未检测到内源SS基因。初步证据显示,在转基因青蒿植株中,突变型SS基因已取代野生型SS基因。结论青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功。
- 冯丽玲杨瑞仪杨雪芹曾庆平
- 关键词：青蒿鲨烯合酶基因打靶基因敲除
