李海燕
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 供职机构：沈阳药科大学生命科学与生物制药学院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位被引量：1
- 2012年
- 目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,MR)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。
- 左小虎刘波巩新唱韶红胡晓李海燕张部昌曹诚吴军
- 关键词：人溶菌酶EGFP巨噬细胞甘露糖
- 重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化
- 2012年
- 目的:建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子(mVEGF)的制备方法,为研究mVEGF的生物活性、抗原性等提供基础。方法:通过全基因合成方法获得编码mVEGF的基因片段,将其克隆至表达载体pPICZαA上,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白;用还原型和非还原型SDS-PAGE检测目的蛋白的聚体状态,用Western印迹验证纯化蛋白;通过PNGase F酶切分析目的蛋白的N-糖基化修饰;通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验检测目的蛋白的生物活性。结果:获得mVEGF的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE分析可见GS115表达的重组mVEGF在还原状态下表观相对分子质量约为20×103,在非还原状态下约为40×103;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗mVEGF抗体特异性结合,PNGase F酶切后相对分子质量降至18×103左右,证明目的蛋白发生了N-糖基化修饰;细胞测活实验表明,mVEGF具有刺激HUVEC增殖的生物活性。结论:利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组mVEGF。
- 李海燕刘波唱韶红巩新徐威吴军
- 关键词：毕赤酵母重组蛋白N-糖基化
