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慢病毒载体介导的RNAi双敲除ABCG2和UGT1A1的Caco-2细胞模型被引量：1: 2013年; 目的:构建以Caco-2细胞为研究对象,由慢病毒载体介导ABCG2和UGT1A1基因RNAi干扰的肠道药物吸收和代谢模型。方法:应用慢病毒载体介导的RNAi技术敲除Caco-2细胞的ABCG2和UGT1A1基因,构建双RNAi干扰ABCG2和UGT1A1的Caco-2细胞系。应用RT-PCR,Real-time PCR,Western blotting等方法检测ABCG2和UGT1A1在mRNA及蛋白水平的表达。然后选择干扰高表达细胞株,连续传代监测干扰相应干扰基因的表达变化。结果:成功构建了慢病毒载体介导的RNAi双干扰Caco-2细胞模型,慢病毒ABCG2和UGT1A1单基因干扰效率分别为75%和88%;分组先RNAi ABCG2后RNAiUGT1A1的双基因RNAi干扰效率分别为72.3%和85.7%;分组先RNAi UGT1A1后RNAi ABCG2的双基因干扰效率分别为69.7%和88.7%;ABCG2与UGT1A1基因的RNAi干扰先后顺序与最终双干扰效果无显著性差异(P>0.05)。Western blotting方法验证ABCG2与UGT1A1的蛋白水平表达也分别相应地明显减少。结论:第一次应用慢病毒载体在Caco-2细胞上同时干扰ABCG2和UGT1A1基因表达。为研究肠道中ABCG2和UGT1A1对口服药物或外源化合物吸收和代谢的联合作用提供可靠细胞模型。; 龚淑敏李光明董莉真吴志敏程彬张斌朱泽; 关键词：慢病毒载体 ABCG2 UGT1A1 CACO-2细胞 RNAI

构建用慢病毒载体介导的RNAi敲除ABCG2的Caco-2细胞模型被引量：2: 2010年; 目的:用重组构建的靶向ABCG2基因的慢病毒载体,感染Caco-2细胞,构建长期稳定敲除ABCG2蛋白的口服药物肠吸收的Caco-2细胞体外模型。方法:采用三质粒系统慢病毒重组技术,针对ABCG2基因的4个靶点,构建4个靶向ABCG2基因的慢病毒和1个不靶向ABCG2基因的对照组慢病毒,感染Caco-2细胞,应用RT-PCR,real-time PCR进行定性和半定量检测ABCG2在细胞中mRNA水平的表达,用Western blotting检测其蛋白水平的表达。结果:慢病毒Lv-ABCG2-sh1、2、3、4感染的细胞组与Lv-Negative-sh对照组相比,ABCG2的mRNA表达量分别下调了11%、77%、2%和65%,蛋白水平的表达也相应地减少,Lv-ABCG2-sh2细胞组具最高敲除效率。结论:用慢病毒载体介导的RNAi成功构建了长期稳定敲除ABCG2的Caco-2细胞模型。; 李伟霞李咏梅李光明杜文才张斌程彬朱泽; 关键词：ABCG2 CACO-2细胞慢病毒载体 RNAI

基于慢病毒载体系统构建重组JSRV-NM假病毒被引量：1: 2014年; 目的采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒,克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增,不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP,以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G,转染293T细胞,复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度,用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒,可超速离心浓缩成高滴度(1×108TU/mL)的病毒,Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数(MOI)=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒,能够在293T细胞中复制和扩增,产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性,符合二级生物实验室安全的要求。; 龚淑敏李光明吴志敏董莉真程彬张斌朱泽; 关键词：假病毒慢病毒载体 ENV基因

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张斌