毛莹莹
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：南方医科大学生物技术学院更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目广州市重大科技专项计划项目广东省科研条件建设项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 3种腺相关病毒介导的绿色荧光蛋白对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率被引量：1
- 2012年
- 目的比较3种不同血清型腺相关病毒(AAV)介导的绿色荧光蛋白对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率。方法原代分离培养西藏小型猪胚胎成纤维细胞并进行形态学鉴定,按照感染复数(MOI)为103、104、105转染传代两次的猪胚胎成纤维细胞,流式细胞学检测不同血清型AAV对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率,并在倒置显微镜下观察转染后绿色荧光的表达强度;同时,应用MTT方法检测不同血清型AAV对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的毒性。结果腺相关病毒AAV2-EGFP对PFF的转染效率随MOI值的增加而增高,MOI为103、104、105时,转染效率分别为(33.68±1.18)%、(50.80±2.59)%和(60.08±1.08)%,而其他两种血清型病毒感染效率均低于AAV2-EGFP。3种病毒转染PFF过程中,细胞生长正常,MTT显示各个转染组与对照组(未转染组)在D570处吸光度无显著差异。结论AAV2血清型载体对体外培养的猪胚胎成纤维细胞的感染效率显著高于其他几种血清型,AAV8和AAV9对PFF感染能力极差,筛选AAV2作为西藏小型猪基因打靶的最适病毒载体;同时,3类血清型病毒载体对猪胚胎成纤维细胞均无明显细胞毒性。
- 黄威毛莹莹刘薇唐华揭飞龙李红卫顾为望
- 关键词：腺相关病毒西藏小型猪胚胎成纤维细胞绿色荧光蛋白流式细胞技术
- 大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达被引量：2
- 2013年
- 目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。
- 裴娜娜吴丽红高永新毛莹莹罗杰黄威刘闻张屹顾为望李红卫
- 关键词：瘦素腺相关病毒载体神经元细胞
