史海粟
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 供职机构：江南大学食品学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程更多>>
- 高山被孢霉中Δ6脱饱和酶关键位点及其对活性的影响
- 2016年
- 高山被孢霉中Δ6脱饱和酶(Ma FADS6)是决定ω3/ω6多不饱和脂肪酸代谢流的关键酶。利用定点突变技术研究Ma FADS6-Ι一级结构与功能的关系,为高山被孢霉多不饱和脂肪酸的合成提供了理论依据。利用非链取代式质粒扩增技术对已构建质粒p YES2/NT C-Ma FADS6-Ι内的表达单元(即Ma FADS6-Ι)中细胞色素b5区(HPGG)下游的位点进行定点突变,将所有突变体分别转化酿酒酵母进行诱导表达,进一步通过在培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察重组菌对各底物的催化作用。实验结果表明,所有突变体催化α-亚麻酸(ALA)的活性没有改变;K61和D68两个位点对催化亚油酸(LA)起关键作用,其对应的4个突变体对LA的转化率分别为(6.2±0.5)%(K61T)、(0.3±0.0)%(K61F)、(8.2±0.7)%(D68N)和(6.6±0.8)%(D68L),相比原始转化率各降低50%以上;G63和T69两个位点对LA的催化无直接影响,但G63T突变体由于突变位点极性改变,其对LA的转化率为(8.5±0.9)%,比原始转化率降低了49.9%;而V66位点的突变体对LA的转化率分别为(22.3±2.6)%(V66T)和(20.7±2.5)%(V66A),比原始转化率分别降低了36.1%和37.8%。确定了Ma FADS6-Ι氨基酸序列中K61和D68两个关键氨基酸位点经突变后均会使其酶活明显降低,这为研究Ma FADS6-Ι一级结构与功能的关系提供了理论依据。
- 史海粟陈海琴顾震南张灏陈永泉陈卫
- 关键词：高山被孢霉定点突变
- 高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定
- 2015年
- 产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。
- 史海粟陈海琴顾震南张灏陈永泉陈卫
- 关键词：高山被孢霉
