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检测白喉毒素特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法的建立: 2013年; 目的建立检测白喉毒素（diphtheria toxin,DT）特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法.方法用MEM培养液对DT进行不同倍数的预稀释,用目测法确定DT的最适预稀释倍数.用建立的方法检测以最适预稀释倍数稀释的DT,以确定该法的灵敏度和细胞病变半数抑制浓度（IC50）,同时绘制剂量-反应曲线以验证该法的重复性.用建立的方法于不同pH、盐浓度或蔗糖浓度条件下检测DT,计算DT回收率以验证该法的耐用性.结果目测法确定的DT最适预稀释倍数为106倍.建立的方法的平均检测灵敏度为（6.01±1.44）×10^-5 lf/ml DT,细胞病变半数抑制率对数值（log IC50）范围为5.02 ～ 5.82,变异系数为5.82％,该法具有较好的重复性.用建立的方法检测不同条件下的DT显示,DT的平均回收率为93.7％～ 110.4％,该法具有较好的耐用性.结论 Vero细胞/MTr法可用于检测DT特异性细胞毒性.; 邓杰张珂袁涛张雪梅; 关键词：白喉毒素 VERO细胞特异性细胞毒性

动态显色法检测白喉毒素突变体CRM197的细菌内毒素含量被引量：10: 2013年; 目的建立检测白喉毒素突变体CRM197细菌内毒素（bacterial endotoxin）含量的动态显色法（kinetic chromo-genic assay,KCA）。方法按照《中国药典》三部（2010版）要求,用细菌内毒素检查用水（bacterial endotoxin,BET）稀释细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准曲线系列溶液,各浓度均设3个平行孔,分别与动态显色鲎试剂（kinetic chromogenic analysis tachypleus amebocyte lysate,KCA TAL）反应,绘制标准曲线,验证标准曲线的可靠性,确定最佳线性范围、测定范围及最低检测限（limit of quantitation,LOQ）,验证方法的精密性和准确性,并进行初步应用。结果标准曲线的回归方程为：y=-0.263x＋2.741,R2=0.997,相关系数的绝对值∣r∣逸0.980,阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间,各复孔的变异系数（CV）约10%;内毒素浓度在0.02～2.50 EU/ml时,线性关系良好,LOQ为0.02 EU/ml;3个浓度（2.50、0.50、0.02 EU/ml）标准内毒素检测结果的CV均〈5%,加入高、中、低3个浓度（2.50、0.50、0.02 EU/ml）标准内毒素的3批供试品检测结果的CV均〈10%,回收率在95%～143%之间;采用建立的方法检测10批次CRM197样品的细菌内毒素含量,回收率在77%～118%之间,其中8批样品的内毒素含量合格。结论动态显色法检测CRM197中内毒素的含量精密性和准确性良好,能快速、定量检测样品中的内毒素含量,抗干扰能力强,可用于CRM197研制过程中的质量控制。; 邓杰张珂袁涛李春阳; 关键词：细菌内毒素

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6生物学活性工作标准品的校准和稳定性研究: 2013年; 目的对聚乙二醇化重组人白细胞介素-6生物学活性工作标准品进行校准和稳定性研究。方法按《中国药典》三部(2010版)的要求,检测工作标准品的生物学活性,以IL-6国际标准品进行校准,并研究其在不同温度下放置的稳定性。结果聚乙二醇化重组人白细胞介素-6工作标准品经8次试验,每次分别在3个96孔板上检测生物学活性,并以国际标准品进行校准,共获得24个校准活性结果。平均生物学活性的95%可信区间为2.0×106～3.8×106AU/mL,单次测定范围为1.9×106～3.8×106AU/mL,平均可信限率为3.771%。工作标准品分别在-20℃、4℃、25℃、37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论所制备的工作标准品可用于聚乙二醇化重组人白细胞介素-6中试工艺的研究和每批产品质量的评价。; 邓杰张珂饶海林王智杰赵兆曾海鹏李晓容周宇袁涛; 关键词：生物学活性工作标准品稳定性

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6工作标准品的制备被引量：3: 2012年; 目的制备重组人白细胞介素-6(Recombinant human interleukin-6,rhIL-6)和聚乙二醇化rhIL-6(PEG-rhIL-6)理化工作对照品和rhIL-6冻干体外生物学活性工作标准品,用于PEG-rhIL-6制备过程中各步样品纯度、理化指标及体外生物学活性测定。方法制备rhIL-6和PEG-rhIL-6,并对其进行全面检定,作为理化工作对照品。另取精确定量的rhIL-6,用含冻干保护剂的缓冲液稀释分装冻干,制成冻干制品后对其进行全面检定及稳定性考察,作为体外冻干生物学活性工作标准品。结果两种理化工作对照品和冻干体外生物学活性工作标准品各项常规检测指标均符合暂定规程要求;两种理化工作对照品结构分析结果证实与理论值相符;冻干体外生物学活性工作标准品加速稳定性试验证明其体外活性稳定。结论制备的两种理化工作对照品和冻干体外生物学活性工作标准品可用于PEG-rhIL-6中试工艺的研究和评价。; 袁涛张珂李征王智杰邓杰周宇赵兆饶海林张雪梅; 关键词：聚乙二醇化白细胞介素6 工作标准品

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达被引量：3: 2014年; 目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。; 周宇赵兆袁涛李晓容李春阳; 关键词：白喉毒素克隆载体蛋白

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袁涛

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