雷杰 作品数:34 被引量:93 H指数:5 供职机构: 广州市胸科医院 更多>> 发文基金: 广州市科技计划项目 广东省科技计划工业攻关项目 广东省自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 更多>>
稀释剂种类和冻融次数对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响 被引量:2 2019年 目的探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。方法 分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl的5个浓度检测液各5份,在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测,比较其Ct值。结果 ①浓度1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl时,冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后,质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中,实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32(P>0.05),23.52和23.61(P>0.05),26.77和26.37(P>0.05),32.73和30.88(P<0.05),33.08和31.51(P<0.05)。②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次,在ddH2O和TE缓冲液中,各浓度标准品Ct值中位数分别如下:1×108拷贝/μl:17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94(P>0.05)和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62(P>0.05);1×10^7拷贝/μl:22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89(P<0.05)和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05(P<0.05);1×10^6拷贝/μl:24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40(P<0.05)和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53(P<0.05);1×10^5拷贝/μl:29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39(P<0.05)和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44(P<0.05);1×10^4拷贝/μl:31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41(P<0.05)和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31(P<0.05)。结论 相对于ddH2O,质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定。质粒标准品随着冻融次数增多,其稳定性越差,因此要避免反复冻融质粒标准品。 雷杰 牛群 王楠 杨瑜 谢贝 刘志辉 孟繁荣关键词:冻融 稀释剂 实时荧光定量PCR 结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变与其他抗结核药物耐药的相关性 被引量:3 2023年 目的探讨不同抗结核药物对结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变的影响,以进一步准确理解结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子机制。方法在广州地区分枝杆菌菌株库中选择异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、阿米卡星、克拉霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、丙硫异烟胺和对氨基水杨酸等11种抗结核药物的药敏性试验临床测定结果明确的结核分枝杆菌分离株进行katG、mabA-inhA、oxy RahpC、kasA和ndh基因测序,以结核分枝杆菌H37Rv标准序列为参照进行基因突变分析,应用卡方检验对比分析H^(-)(R/F/O)^(-)与H^(-)(R/F/O)^(+)、H^(+)R-与H^(+)R^(+)、H^(+)F^(-)与H^(+)F^(+)和H^(+)O^(-)与H^(+)O^(+)几大菌群之间5种基因突变发生总频率的差异(其中R、H、F、O分别代表利福平、异烟肼、左氧氟沙星与莫西沙星2种氟喹诺酮类药物和其他7种药物,“+”表示耐药、“-”表示敏感)。结果在143株异烟肼敏感结核分枝杆菌株中,H^(-)(R/F/O)-耐药表型株中5种异烟肼耐药相关基因的突变总频率为11.32%(12/106),在37株H^(-)(R/F/O)+耐药表型株中则为40.54%(15/37),两者间差异有统计学意义(χ^(2)=15.289,P<0.001);在224株异烟肼耐药结核分枝杆菌株中,H^(+)R-、H^(+)R^(+)、H^(+)F^(-)、H^(+)F^(+)、H^(+)O^(-)和H^(+)O^(+)六大菌群的突变总频率分别是47.87%(45/94)、93.85%(122/130)、68.64%(116/169)、89.09%(49/55)、55.56%(15/27)和77.16%(152/197),H^(+)R-与H^(+)R^(+)、H^(+)F^(-)与H^(+)F^(+)和H^(+)O^(-)与H^(+)O^(+)之间基因突变总频率差异有统计学意义(χ^(2)=60.778、11.99、5.841,P<0.001、0.001和0.016)。结论结核分枝杆菌INH耐药相关基因突变虽然取决于对INH的敏感性,但是否同时对其他抗结核药物耐药也可产生重要影响,值得人们深入研究。 龚兰 牛群 王楠 王楠 吴玲 雷杰 谢贝 吴玲 李华 杨瑜 谢贝 孟繁荣关键词:结核分枝杆菌 异烟肼 基因突变 广东地区结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因变异特征 被引量:4 2022年 目的探讨广东地区不同耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药基因rpoB变异特征,为更精准快速分子检测技术的研发提供依据。方法从分枝杆菌菌种保藏库中筛选利福平(R)、异烟肼(H)、乙胺丁醇(E)、链霉素(s)敏感性明确的结核分枝杆菌临床分离株373株。对373株临床分离株采用聚合酶链式反应技术扩增包含利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因片段并进行序列测定与分析。结果(1)373株菌株样本中,192株检测到rpoB基因变异,共发生225个突变包括碱基置换、插入、缺失在内的40种突变种类,531、526、511、516、533、515位点突变最为常见,占比分别为43.11%(97/225)、20.89%(47/225)、10.22%(23/225)、8%(18/225)、4.44%(10/225)、4%(9/225);(2)192例rpoB突变株中,159株仅发生单位点突变,33株发生双位点突变,其中D516V、H526L、H526D、H526R、S531W等14种突变种类只在单位点突变中出现,为单位点特有变异,M515T、H526Q、D516G、M515V、E541A等21种突变种类只在双位点突变中出现,为双位点特有变异,S531L、L511P、H526Y等5个种类突变为单双位点共有变异,不存在3个位点的同时变异。(3)对4个一线药物全敏感菌株(Q)、R敏感H耐药株(RSHR)、R耐药H敏感株(RRHS)和耐HR株(MDR)的rpoB基因突变率分别为4.67%(5/107)、28.42%(27/95)、90.62(29/32)、94.24%(131/139),除RRHS与MDR株间突变率不具统计学差异外(P>0.05),Q/R^(S)H^(R)、Q/R^(R)H^(S)、Q/MDR、R^(S)H^(R)/R^(R)H^(S)、R^(S)H^(R)/MDR间rpoB基因突变率具有统计学差异(均P<0.001)。结论广东地区结核分枝杆菌rpoB基因突变具有多样性、地域性特点,不同耐药表型可能对rpoB基因突变产生深远影响。 孟繁荣 雷杰 牛群 王楠 吴玲 杨瑜 谢贝 李华 高俊文 傅红梅 刘志辉关键词:结核分枝杆菌 RPOB基因 基因突变 结核杆菌临床分离菌早期培养滤液蛋白质组的比较 被引量:1 2013年 目的:初步了解结核杆菌体外液培养条件下的早期蛋白质代谢和分泌活动状况。方法:将2株对抗结核一线药物敏感的结核杆菌临床分离茵接种Middlebrook7H9液体培养基进行培养,并于培养第7天用0.22μm滤纸过滤培养液制备早期培养滤液,应用与弱阳离子交换蛋白质芯片(WCX2)捕获滤液蛋白行表面增强激光解吸一电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-Ms)检测,描述性分析比较其蛋白质组。结果:在2株结核杆菌7d培养滤液中分别检测到相对分子质量为982~9329与941。9331、丰度为7~210与11-368(通过质谱峰面积计算相对强度值表示)的164与194种蛋白质;与Middlebrook7H9液体培养基本身蛋白质组比较,在2株结核杆菌7d培养滤液中分别有153和183种蛋白质新产生(其中10种在2份滤液中均有存在)、92和90种蛋白质消失、10和13种蛋白质丰度变小。结论:在体外液体培养条件下,结核杆菌蛋白质代谢和分泌活动活跃。且不同菌株间有较大差异。 黄业伦 孟繁荣 谢贝 曹翌明 牛群 雷杰 谭守勇 张言斌 吴玲 邓晓华 刘志辉关键词:结核杆菌 一种可同时进行结核分枝杆菌鉴定及指示其利福平敏感性的新方法 目的 建立一种可同时进行结核分枝杆菌鉴定并检测结核分枝杆菌利福平耐药突变基因的分子方法.方法 以“TGTTCTTCAAGGAGAAGCG”“TCGTCGGCGGTCAGGTA”为上下游引物对101株结核分枝杆菌复合群及5... 孟繁荣 牛群 雷杰 刘炜雯 谭守勇 刘志辉关键词:菌种鉴定 利福平耐药 中国氟喹诺酮耐药结核分枝杆菌gyr基因序列特征分析 被引量:4 2020年 目的明晰我国氟喹诺酮类药物耐药结核分枝杆菌株gyrA、gyrB基因突变的分子特征。方法以检索式"quinolones resistance AND Mycobacterium tuberculosis AND(China OR Hong Kong OR Tai Wan OR Macon)"和"结核AND喹诺酮耐药"分别在英文数据库(pubmed、Embase、SciFinder)和中文数据库(万方、中国知网、中国生物医学文献服务系统与维普期刊资源服务平台)中检索有关我国结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐药基因突变的研究文献,对符合纳入标准的文献中氟喹诺酮耐药基因gyrA、gyrB进行突变位点和氨基酸变化类型等计数资料的信息提取和分析。结果 32篇外文和23篇中文文献纳入研究,3 641株氟喹诺酮类耐药结核分枝杆菌的gyrA基因得到分析,其中1 958株同时分析了gyrB基因。3 641株耐药菌中,2 830株检测到gyrA基因突变(突变率为77.73%),共47种突变类型,均为氨基酸错义突变,其中单位点、双位点突变的发生率分别为75.83%和1.92%,94、90、91位密码子突变率分别为49.33%(1 796/3 641)、19.14%(697/3 641)、5.80%(211/3 641),出现频率最高的突变类型依次为Asp94Gly、Ala90Val、Asp94Ala、Asp94Asn、Ser91Pro、Asp94Try;1 958株耐药菌中,175株发生gyrB基因突变(突变率为8.94%),其中56株的29个突变类型为gyrB单基因突变,其余119株36种突变类型与gyrA基因突变共同发生,占gyrB序列突变的68%。结论我国结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药株gyrA基因突变以94、90、91位密码子单位点突变为主;gyrB基因突变位点较为分散,常与gyrA基因突变伴随发生。 孟繁荣 杨瑜 雷杰 王楠 李华 谢贝 邓丽 牛群 竺澎波 高俊文 刘志辉关键词:结核分枝杆菌 氟喹诺酮耐药 GYRA GYRB 异烟肼敏感与耐药结核杆菌临床分离株培养滤液蛋白比较分析 被引量:1 2014年 目的:寻找异烟肼耐药结核杆菌特异性分泌蛋白。方法应用弱阳离子交换蛋白质芯片( WCX2)捕获并应用表面增强激光解析-电离飞行时间质谱( SELDI-TOF-MS)技术对1株异烟肼单耐药结核杆菌和1株异烟肼敏感结核杆菌临床分离株7天及14天Middlebrook 7H9培养滤液蛋白进行比较,描述性分析其差异。结果在异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌株7天及14天Middlebrook 7H9培养滤液中分别检测到164、175、133、147种蛋白质/多肽,其相对分子量(依质荷比m/z而得)范围分别为982~9328、997~9327、1050~8903、996~9369,表达丰度(通过质谱峰面积计算)分别为17~2100、21~1943、60~5355、41~3267;异烟肼单耐药结核杆菌株与异烟肼敏感结核杆菌株相比较,7和14天培养滤液分别存在47与58种差异蛋白质/多肽,这些差异蛋白质相对分子量在1083~8812、1012~9327之间,表达丰度在76~1811、25~3010之间。结论异烟肼敏感结核杆菌和耐药结核杆菌液体培养早中期滤液蛋白质存在差异,但是否为异烟肼耐药结核杆菌特异性分泌蛋白则有待进一步证实。 曹翌明 孟繁荣 谢贝 蔡杏珊 黄业伦 牛群 雷杰 高俊文 谭耀驹 刘志辉关键词:结核杆菌 异烟肼 以居住地域为基础的广州地区结核病传播链分子流行病学初探 被引量:1 2020年 目的探讨MIRU-VNTR基因分型技术用于分析广州地区结核病传播关系的可行性。方法以结核患者居住地所属乡镇村组或社区街道相同为前提,假定居住所属地相同结核患者间存在传播关系,拟定广州地区结核病传播链。培养结核分枝杆菌临床分离株并提取DNA,通过PCR扩增进行29位点MIRU-VNTR基因分型分析,并计算HGDI分辨力指数。以基因型成簇与否评价传播链内结核患者间传播关系的有无。结果拟定了178条广州地区结核病传播链,复苏得到456株结核分枝杆菌临床分离株,提取获得其基因组DNA并扩增了29个VNTR位点,其组合HGDI分辨力指数为0.986。基因成簇性分析显示,有2条传播链内患者结核分枝杆菌临床分离株基因成簇,成簇率为1.10%。基因成簇性的2条传播链患者分别居住于同街道,发病时间间隔在2年以内,分别为9和14个月。结论29位点MIRU-VNTR基因分型技术可用于广州地区结核分枝杆菌基因型分析,能否用于结核病传播关系需要进一步深入研究。 竺澎波 王楠 孟繁荣 杨瑜 雷杰 牛群 谢贝 吴玲 李华 刘志辉 刘文关键词:结核 结核分枝杆菌 传播链 MPT64在MTB利福平和异烟肼耐药性检测方法中的应用 被引量:4 2021年 目的建立一种以MPT64为指标的结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测的快速方法,探讨MPT64在MTB利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性检测中的应用。方法应用胶体金免疫层析法(GICA)分别检测MTB敏感株和耐多药株在含(观察组)与不含(对照组)RFP、INH的Middlebrook 7H9液体培养基上培养3、7、10 d的培养液中的MPT64,通过凝胶成像仪白光源拍照进行条带灰度分析(Image Jab Software 3.0),比较敏感株和耐多药株间的灰度比值的差异,依据受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析确定RFP、INH耐药的灰度比值界值;以比例法检测结果为金标准,评价新建方法的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果对照组中,随着培养时间的延长,12株MTB敏感株和11株耐多药株的灰度比值增大;观察组中,敏感株在不同的培养时间的灰度比值没有显著变化,而耐多药株则明显增大。3、7、10 d敏感菌与耐多药菌在药物培养基中MPT64检测灰度比值差异均有统计学意义(P均<0.05)。依据观察组灰度比值分别绘制以MPT64指示的RFP和INH耐药性检测的ROC曲线,两者的3 d AUC分别为0.84和0.77,灰度比值界值均为0.05;7、10 d AUC均为1.00,7 d的灰度比值界值分别为0.23与0.20;10 d的灰度比值界值分别为0.49和0.48。GICA检测MPT64用于34株MTB的RFP、INH耐药性鉴定的准确度分别为97%和94%,灵敏度分别为93%和86%,特异度均为100%,阳性预测值均为100%,阴性预测值分别为95%和91%。结论 GICA检测MPT64于MTB培养7 d时能准确检测抗结核药物RFP、INH耐药性,MPT64可作为MTB药敏试验的有效检测指标。 杨瑜 李华 邓丽 雷杰 王楠 谢贝 吴玲 刘志辉 孟繁荣关键词:MPT64 药物耐药性 胶体金免疫层析法 宁德市区常住人口骨量减少患者流行病学及中医辨证分型研究 2021年 目的根据宁德市区常住人口的骨密度检查及中医证型,探讨中医药防治骨质疏松的效果。方法选取2019年1月至2020年1月来本院治未病中心体检患者1 049例,按骨密度T值分为正常、骨量减少和骨质疏松患者,通过问卷调查、四诊信息采集表及望闻问切等方式收集患者相关信息,选取其中骨量减少患者,根据四诊合参,按"2015年中医药预防和治疗POP专家共识"辩证分型。结果宁德市区中老年常住人口中骨量减少患者的辨证分型与患者的年龄增长无关,肝肾阴虚证的人数最多,其次为脾肾阳虚证、肾虚血瘀证、肾阳虚证、脾胃虚弱证及气滞血瘀证。结论骨量减少患者是十分庞大的群体,其诊断及治疗应引起人们的重视,中医辨证因着重从肝、肾、脾等方面入手,而对于沿海地区应重视脾的影响。 雷杰 陈郑增 程寿康 许灿康 蔡德正关键词:中老年 骨密度 骨量减少 中医辨证