徐柯
- 作品数：21 被引量：23H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 表达HIV-1CRF01_AE gp145的rMV MVA疫苗构建及免疫原性评价被引量：1
- 2015年
- 目的 构建携带密码子优化型HIV-1 CRF01_AE gp145基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株（MVA）载体疫苗,并对其免疫效果进行初步评价.方法 利用前期研究获得并改造的HIV-1CRF01_AE env共享基因,去除其胞内区序列得到gp145基因,将此基因克隆至重组MVA载体系统的穿梭质粒pSC11上,以穿梭质粒转染提前感染了野生型MVA病毒的BHK-21细胞,通过同源重组获得携带gp145基因的重组MVA疫苗,即rMVA-AEgp145.经鉴定证实重组MVA疫苗可表达Gp145蛋白后,在BALB/c小鼠中进行rMVA-AEgp145疫苗单独免疫的效果评价.结果 重组MVA疫苗可有效表达Gp145蛋白,单独免疫BALB/c小鼠能诱导较高水平的细胞免疫反应.结论 成功构建了表达HIV-1 CRF 01_AEgp145基因的重组MVA疫苗,在小鼠体内单独免疫可以诱导较强的env特异性CTL应答。
- 湛倩倩陈丹瑛叶景荣余双庆徐柯曾毅冯霞
- 关键词：艾滋病疫苗
- 表达SIV Gag/Env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒三载体疫苗联合免疫小鼠的细胞免疫研究被引量：2
- 2016年
- 获得性免疫缺陷综合征即艾滋病是人类面临的严重公共卫生威胁,目前常用的药物疗法仍存在一定的缺陷,尚不能彻底治愈AIDS并阻断HIV的传播。将治疗型疫苗用于HIV感染的治疗具有一定的发展潜力,但缺乏适宜的HIV感染动物模型阻碍了治疗型HIV疫苗的研制。SIV能够感染非人灵长动物并引起类似AIDS的猴免疫缺陷病,因而常被用作研究HIV及其疫苗的替代动物模型。为了对SIV疫苗在猴感染模型中治疗SIV感染的效果进行评价,我们分别构建了表达SIV gag和env基因的DNA疫苗、重组腺病毒和重组痘苗病毒疫苗,并联合使用这三种疫苗免疫小鼠,对包括不同抗原组合、不同免疫次序及间隔的免疫策略进行探索和优化。IFN-γ酶联免疫斑点和小鼠体内杀伤试验的结果显示,通过三载体疫苗联合免疫,能够在小鼠体内诱导出强度较高、持续时间较长的SIV Gag/Env特异性细胞免疫反应。并且,重复免疫后仍可以诱导较高水平的免疫反应。该结果为在SIV感染猴模型中评价多载体疫苗序贯和重复免疫治疗SIV感染的研究奠定了基础,也为治疗型HIV疫苗的研究提供了参考。
- 何小周陈丹瑛王琬玓徐柯曾毅冯霞
- 关键词：SIVDNA疫苗重组腺病毒重组痘苗病毒
- HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列分析及表型预测
- 2014年
- 目的 克隆并分析HIV-1B/C重组型外膜蛋白env基因序列,根据其氨基酸序列进行表型预测,为疫苗的抗原设计奠定基础.方法 采集北京地区HIV-1 B/C重组型的抗凝全血标本,分离血浆和提取基因组DNA,采用巢式PCR方法扩增rev-env基因,对扩增产物进行序列测定.根据核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列,并对重要的Env功能结构域进行深入的分析和比较.结果 从12例B/C重组型HIV-1感染者中成功克隆到7个rev-env基因,序列分析发现其中6个有完整的开放读码框（ORF）,全部为CRF_07B/C重组型.6个Env蛋白氨基酸N糖基化位点和数目没有显著变化;CD4受体结合位点高度保守;根据V3环氨基酸序列及静电荷数目预测全部使用CCR5辅助受体;GP120/GP41剪切位点高度保守,预测所有GP160前体都能有效剪切;对几个已知中和抗体的中和位点分析推测全部的6个序列都对2G12、2F5中和不敏感;对4E10、PG9及PG16中和敏感.结论 有必要进一步阐明env基因型与相关功能的关系,这将为疫苗和药物研究提供依据.
- 汪孟冉陈丹瑛何小周叶景荣余双庆徐柯曾毅冯霞
- 关键词：HIV-1
- HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建被引量：4
- 2014年
- 目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因（wt.AE env）相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.
- 陈丹瑛汪孟冉何小周叶景荣余双庆李秦剑徐柯曾毅冯霞
- 关键词：艾滋病疫苗密码子
- 食品和加工材料表面SARS-CoV-2存活规律研究被引量：3
- 2022年
- 目的分析新型冠状病毒在不同食品和加工材料表面存活规律,为制定预防病毒通过食品和加工材料传播的防控措施和风险评估提供参考。方法将病毒培养物接种至常见进口食品和加工材料表面,使用荧光定量PCR方法测定在不同温度和时间条件下样本表面病毒核酸载量;使用半数组织培养感染剂量实验测定病毒滴度,观察病毒存活时间。使用线性回归模型计算病毒半衰期。结果食品和加工材料表面病毒核酸载量随时间下降,且温度越高病毒核酸载量下降越快。不同种类食品和加工材料表面病毒存活时间不同,室温条件下,猪肉和车厘子表面病毒存活24 h;其次为带鱼和鲜橙表面。加工材料表面病毒存活时间均较短,小于24 h。4℃条件下,病毒在猪肉表面至少存活1周,其次为车厘子和带鱼。-20℃条件下,病毒在猪肉和塑料包装表面的活性下降缓慢,8周后病毒滴度仍然较高,而在带鱼和纸板表面的活性下降明显。结论不同食品和加工材料表面的病毒核酸存续时间和存活规律不同,且温度越低病毒存活时间越长,应根据食品、加工材料类型,以及生产环境条件制定针对性预防和消毒措施。
- 李夫徐柯潘阳刘培培冯兆民张靖雷雯雯杨梦婕梁志超张代涛杨鹏武桂珍王全意
- 关键词：新型冠状病毒食品病毒活性
- 负载Ad5-HIVgag/env的DC疫苗在小鼠体内的免疫原性研究
- 2016年
- 目的 用Ad5-HIV gag/env负载小鼠树突状细胞（Dendritic cell,DC）,探索其在小鼠体内诱导的HIV Gag/Env特异性细胞免疫应答.方法 贴壁法分离纯化BALB/c小鼠DCs,并用细胞因子诱导DC细胞成熟,采用流式细胞术鉴定其纯度.利用重组腺病毒Ad5-HIV gag/env感染DC细胞,制备DC疫苗.用所制备DC疫苗免疫小鼠,在免疫后的不同时间点,用ELISPOT方法检测小鼠体内HIV特异性细胞免疫应答水平.结果 成功培养出Ad5-HIVgag/env负载的DC疫苗;免疫荧光以及流式细胞术检测到Gag/Env抗原可在DC内有效表达;上述DC疫苗免疫小鼠后能诱导高水平HIV特异性细胞免疫反应.结论 Ad5-HIV gag/env负载的树突状细胞疫苗可以在小鼠体内诱导较强的HIV特异性细胞免疫反应.
- 刘超何小周刘雪徐柯曾毅冯霞
- 关键词：树突状细胞疫苗HIV-1HIV-1
- 慢病毒介导白介素IL15在人树突状细胞中表达研究被引量：3
- 2014年
- 目的本研究建立了表达人白细胞介素15的重组慢病毒，验证其在人树突状细胞中的表达，希望以此用于疫苗佐剂或基因免疫治疗。方法从人PBMC中扩增IL15基因，克隆至慢病毒表达质粒中，用plvx．ILl5-Ires—gfp包装出重组慢病毒，感染293T细胞用以验证目的基因IL15表达。结果抗生素筛选获得表达IL15的细胞系，目的基因能够在体外稳定的表达。结论构建的慢病毒能够在人未成熟树突状细胞中稳定的表达IL15，可以进一步作为疫苗佐剂或基因免疫治疗使用。
- 徐柯冯霞余双庆曾毅胥少华
- 关键词：白细胞介素15基因树突细胞
- HIV-1特异性单抗2G12单价抗体的构建及活性分析
- 2015年
- 目的构建单价抗体并与IgG比较结合活性及中和活性的差异。方法对IgG1抗体重链恒定区基因进行改造,分别构建N端截短型的IgG1重链恒定区基因IgG1-tH和去除绞链区二硫键及CH2、CH3区的稳定非共价键的2G12重链基因2G12-HM。将IgG1-tH与2G12抗体重链和轻链基因表达质粒共转染293T细胞,表达含有完整Fc的单价抗体;将2G12-HM和轻链基因表达质粒共转染293T细胞,表达半分子型的单价抗体。通过非还原SDS-PAGE对表达抗体的大小进行鉴定,并用ELISA和微量中和实验比较原型2G12抗体和单价抗体的结合活性及中和活性。结果以HIV-1中和抗体2G12为模型通过基因改造成功表达了两种单价抗体,一种为完整的重链、轻链以及N端截短型的重链分子组成的包含1个Fab和1个Fc的单价抗体2G12-tH;另一种为1条重链和1条轻链组成的半分子型单价抗体2G12-HM。两种抗体均可与抗原有效结合,且与IgG分子相比差异无统计学意义。中和实验结果发现IgG抗体能中和的,病毒两种单价抗体也均能中和。结论成功构建了两种单价抗体,与IgG相比其结合活性和中和活性无明显变化。
- 冯一帆刘雪徐柯冯霞曾毅余双庆
- 关键词：人类免疫缺陷病毒中和活性
- 利用流感病毒反向遗传学操作系统表达绿色荧光蛋白(EGFP)被引量：2
- 2013年
- 目的构建基于RNP复合体的流感病毒反向遗传学操作系统,并利用该系统表达绿色荧光蛋白。方法将人源pol Ⅰ启动子分别插入真核表达载体pcDNA3和原核质粒pUC18,获得pol Ⅰ/pol Ⅱ双启动子表达载体pCHBW和pol Ⅰ单启动子表达载体pPol IR;来源于禽流感病毒H5N1湖北分离株A/Chicken/Hubei/489/2004的基因被克隆到pCHBW上,获得pCHBW-PB2、pCHBW-PB1、pCHBW-PA、pCHBW-NP;将荧光蛋白基因置换NA基因的编码区进而克隆到pPol IR上获得pPol IR-NA(EGFP);这些质粒共转染293T细胞并观察荧光。结果所构建的载体均经酶切和测序验证正确。pCHBW-PB2、pCHBW-PB1、pCHBW-PA、pCHBW-NP和pPol IR-NA(EGFP)共转染293T细胞后能观察到绿色荧光,Western-blot实验证实被转染的293T细胞表达绿色荧光蛋白(EGFP)。结论基于RNP复合体的反向遗传操作系统构建成功,并表达绿色荧光蛋白。
- 徐柯邢学森吴杨喻明霞龚晓艳徐军强
- 关键词：反向遗传学克隆转染293T细胞
- 含密码子优化的SIV gag基因的DNA疫苗与rAd5疫苗构建及免疫原性评价被引量：3
- 2014年
- 目的 构建含有SIVgag基因的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗,为后期在SIV感染的猴模型中进行多载体疫苗联合免疫策略的治疗效果评价奠定基础.方法 将SIV gag基因按照哺乳动物偏嗜密码子进行优化并构建至pVR载体,作为DNA疫苗.以Western Blot方法比较优化前后gag基因表达水平.将优化后的gag基因插入重组腺病毒载体,构建rAd5-SIVgag疫苗.在BALB/c小鼠中分别比较DNA疫苗及rAd5-SIV.gag疫苗单独及联合免疫的效果.结果 密码子优化的SIVgag基因的表达水平远高于野生型SIVgag基因.重组腺病毒疫苗免疫一次或两次诱导的细胞免疫反水平分别高于DNA疫苗免疫一次或两次.两种疫苗联合免疫的反应水平与腺病毒疫苗免疫两次的水平相当,高于DNA疫苗单独免疫及腺病毒疫苗单独免疫一次的结果.结论 成功优化了SIV gag基因,使其不依赖Rev高水平表达；成功构建了表达优化后SIV gag基因的DNA疫苗和rAd5疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.
- 陈丹瑛何小周汪孟冉余双庆徐柯李秦剑曾毅冯霞
- 关键词：艾滋病疫苗腺病毒科
