奚绪光
- 作品数：26 被引量：18H指数：2
- 供职机构：西北农林科技大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划教育部留学回国人员科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生理学更多>>
- 鸽子DHX36解旋酶表达纯化及酶学特性分析被引量：1
- 2020年
- 利用生物化学与生物物理学前沿技术系统地分析了鸽子(Columba livia)DHX36解旋酶的酶学特性。通过原核表达纯化系统获得了纯度大于95%的ClDHX36蛋白。利用荧光各向异性法研究ClDHX36的底物结合偏好性,结果表明ClDHX36偏好结合ssRNA、ssDNA和G4,并且优先结合序列中富含鸟嘌呤的ssDNA。通过快速停留光谱技术探索ClDHX36的解旋活性,明确了ClDHX36解旋方向性为3′-5′,更倾向于解旋尾链为Grich和G4的dsDNA底物,且ClDHX36的解旋活性与底物的尾链长度呈负相关性。本研究揭示了ClDHX36在结合和解旋底物过程中均具有明显的底物偏好性,为深入研究DHX36的工作机理提供参考。
- 谢思曼戴阳雪刘娜女奚绪光
- 关键词：蛋白表达纯化结合活性
- DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析
- 2019年
- DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区(N-端181aa)与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。
- 谢艳张倩刘娜女奚绪光
- 关键词：RNA解旋酶
- 单分子荧光共振能量转移数据处理的优化算法
- 2017年
- 单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术是当今单分子生物物理研究领域的重要实验手段,该技术通过测量供体、受体荧光光强以及二者间的共振能量转移效率,揭示标记位点间的距离,用于研究DNA、蛋白质等生物大分子的构象变化.然而,当前传统数据处理方法大量依赖人工干预,噪音大,严重影响了实验效率和数据的可靠性.本文提出了一种针对smFRET数据的自动分析算法.该算法主要包括三个部分:基于计算供体与受体荧光光强的相关系数来确定受体与供体对应荧光点的自动匹配算法、甄别错误点的筛选算法以及基于隐马尔可夫模型的全局拟合算法.经改进后的算法大大简化了传统算法中需要人工干预的步骤,而且自动筛除了实验数据中主要的几类噪音.将改进的算法应用于人类端粒重复序列G-四联体(G4)DNA折叠动力学的数据分析,结果显示优化算法比传统算法能够更快地得到更高信噪比的数据,而且该数据结果清晰地表明G4的折叠体现出多态性并受到钾离子浓度的影响.
- 吕袭明李辉尤菁李伟王鹏业李明奚绪光窦硕星
- 关键词：折叠动力学
- 兔抗人Rig-I蛋白N端CARD结构域多克隆抗体的制备与鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的:制备人维甲酸诱导基因I(hRig-I)N端CARD结构域(hRig-I-N)多克隆抗体。方法:从逆转录病毒载体MigRI-hRig-I中扩增hRig-I基因N端CARD结构域852bp长度的基因片段,克隆入pGEX-4T3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,表达GST-hRig-I-N融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,以Westernblot、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性。结果:在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST-hRig-I-N,ELISA法检测抗体的效价达到1∶125000,Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与原核及真核表达的hRig-I-N蛋白特异结合。结论:制备了高效价、高特异性的hRig-I-N抗体,为进一步研究hRig-I-N的功能奠定了基础。
- 陈磊李咸洋奚绪光
- 关键词：原核表达抗体制备
- 酵母端粒酶RNA的制备及其构型影响因素分析
- 2014年
- 【目的】体外转录并纯化酵母端粒酶RNA,明确缓冲液中组分对其构型的影响,初步研究四膜虫端粒酶相关蛋白p65与酵母端粒酶RNA的结合情况,为酵母端粒酶活性鉴定及构型功能研究奠定基础。【方法】利用核酶的自剪切功能,通过在3′端引入HDV核酶序列获得完整的酵母端粒酶RNA;并用分子筛SuperDeX-200/16/60凝胶过滤纯化酵母端粒酶RNA;琼脂糖凝胶电泳检测RNA Buffer组分中NaCl和MgCl2浓度对酵母端粒酶RNA构型的影响;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测四膜虫端粒酶相关蛋白p65与酵母端粒酶RNA的结合情况。【结果】通过基因序列合成,结合PCR扩增方法获得了酵母端粒酶RNA基因,并将其构建到体外转录载体上;体外转录获得大量的酵母端粒酶RNA(Yeast-RNA-239);使用SuperDeX-200/16/60成功分离得到了纯净的Yeast-RNA-239。NaCl、MgCl2浓度对酵母端粒酶RNA构型有一定的影响,表现为没有NaCl或MgCl2时,RNA的构型均一且致密;随NaCl、MgCl2浓度的增大,RNA构型逐渐变得松散;而四膜虫端粒酶相关蛋白p65能与酵母端粒酶RNA有效结合。【结论】在体外成功制备了高纯度的酵母端粒酶RNA,NaCl、MgCl2浓度对其构型有影响,四膜虫端粒酶相关蛋白p65能够帮助端粒酶RNA正确折叠。
- 谢艳傅晶奚绪光李科友
- 关键词：体外转录端粒酶RNA端粒
- 真核生物FANCJ-like蛋白的结构与进化被引量：1
- 2015年
- FANCJ-like蛋白是一类ATP依赖的5′-3′DNA解旋酶,参与DNA损伤修复、同源重组及G4-DNA拆解,在基因组稳定性维持过程中发挥重要功能。文章系统分析了47种真核生物的FANCJ-like蛋白,对其序列结构特征及起源进化进行了深入探讨。真核生物FANCJ-like蛋白包含4类成员——XPD、CHL1、RTEL1和FANCJ,但在真菌的一些世系及昆虫中存在严重缺失现象,如接合菌门(Zygomycota)缺失了RTEL1,担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)缺失了RTEL1和FANCJ,双翅目昆虫缺失了FANCJ。FANCJ-like蛋白不仅包含经典解旋酶共有HD1和HD2结构域,而且在HD1结构域中插入了自身特有的Fe-S、Arch和Extra-D结构域。Fe-S和Arch结构域在4类成员中较保守,Extra-D结构域在XPD中不存在,在其他3类成员中也各不相同。在FANCJ-like蛋白的Fe-S、Arch和Extra-D结构域中分别发现了7个、10个和2个特有模体;除了已报道的保守模体外,HD1和HD2中分别发现了5个和12个特有模体。从这些特有模体的组成和排布来看,RTEL1和FANCJ最为相近,它们在HD2区包含两个独有模体Vb2和Vc,可能与其G4-DNA解旋活性相关。进化方面的证据表明,FANCJ-like蛋白起源于一种HD1区插入了Fe-S和Arch结构域的DNA解旋酶,在多细胞真核生物出现之前,该蛋白通过3次复制事件和随后的特异化过程,依次形成了目前真核生物所包含的4类FANCJ-like蛋白。
- 吉克伍合武泽峰范三红奚绪光
- 关键词：解旋酶系统发育空间结构
- 小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备
- 2009年
- 【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。
- 陈磊李成洋奚绪光
- 关键词：小鼠原核表达抗体制备
- 嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶生物学活性的分子特征分析被引量：2
- 2018年
- 已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道。本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶(Defe.Pif1)结合活性与解旋活性的分子特征。通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95%以上、无标签的Defe.Pif1蛋白。利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ss DNA与G4 DNA,并对含3'-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为:ss DNA>G4 DNA>3'-ss DNA-ds DNA≈Y-structure>Other substrates。通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L Na Cl、3mmol/L DTT、3 mmol/L Mg Cl2及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5'-G4-ds DNA底物时的解旋幅度超过90%,解旋速率也与其解旋5'-ss-ds DNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式。此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性:与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt-bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt-bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物。上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4 DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性。本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础。
- 段晓雷段晓雷刘娜女闵迅闵迅
- 嗜热毛壳菌端粒酶的表达纯化及酶学特性分析
- 2024年
- 为进一步探究端粒酶的酶学特性,以嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum, Thermo)端粒酶为研究对象,通过生物化学、生物信息学等方法得到4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白,分别与体外转录得到的Thermo端粒酶RNA进行组装。通过端粒酶体外延伸试验检测组装体的反转录活性,进一步分析影响其反转录活性的各种因素。结果表明,4种不同长度的Thermo端粒酶蛋白重组质粒经大肠杆菌表达系统诱导表达后均可得到相应的Thermo端粒酶蛋白,且纯度均在90%以上;体外孵育试验表明,在10 mmol/L HEPES-KOH(pH 8.0)、1 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、体积分数25%Glycerol、10units/μL Rnasin的条件下,端粒酶蛋白与RNA的摩尔浓度比达到1∶1及以上时,两者能有效复合;端粒酶体外延伸试验发现,结构完整的Thermo端粒酶组装体具有很强的反转录活性,可使18nt-DNA引物反复延伸。TEN结构域不完整并未减弱Thermo端粒酶组装体的反转录活性,说明其在反转录过程中未发挥显著作用。T-PK区或TWJ区缺失的组装体均不能使18nt-DNA引物发生延伸,表明RNA结构的完整性是端粒酶发挥反转录功能的必要条件。
- 尹虎宋泽玉奚绪光
- 关键词：蛋白表达纯化
- 牛、果蝇DHX36解旋酶的表达纯化及活性比较
- 2020年
- 【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、反应温度37℃。在此条件下,2种同源DHX36均可结合多种类型核酸底物(ssRNA、ssDNA、parallel G4、anti-parallel G4),且BtDHX36结合平行结构G4底物(parallel G4)的倾向更明显,DmDHX36无此趋势;2种DHX36解旋酶结合不同长度ssDNA的能力不同,BtDHX36更倾向于结合较长的单链DNA底物,而DmDHX36更倾向于结合较短的单链DNA底物;二者均能高效解旋dsRNA和dsDNA底物,DmDHX36更倾向于解旋dsDNA,而BtDHX36无明显倾向性。【结论】成功表达并纯化了BtDHX36和DmDHX36蛋白,确定了其最适结合条件,比较了2种DHX36解旋酶对不同底物的结合及解旋偏好。
- 李康郭海磊奚绪光
- 关键词：蛋白表达纯化
