胡志清
- 作品数：16 被引量：36H指数：4
- 供职机构：苏州大学医学部更多>>
- 发文基金：国防科技工业技术基础科研项目国防基础科研计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 再生丝素膜对Ad-VEGF_(165)转基因成纤维细胞基因表达的影响(英文)被引量：5
- 2008年
- 背景:前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3.0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)。目的:进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF(Ad-VEGF165)转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。设计、时间及地点:对比观察细胞基因工程实验,于2007-11/2008-04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。材料:再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。方法:将Ad-VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞,以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。主要观察指标:通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响;ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。结果:再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达,但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降(P<0.05)。再生丝素膜组Ad-VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达,并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高(P<0.05),而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。结论:再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达,并促进血管生成素1基因的表达,而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。
- 刘铁连谢宇锋盛伟华缪竞成单云波胡志清井莹莹贾红亮杨吉成
- 关键词：血管内皮生长因子腺病毒转基因生物材料
- 逆转录病毒载体介导的hLIF基因真核稳定表达体系的建立
- 2008年
- 目的构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株。方法采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共转染入包装细胞系293T包装逆转录病毒,感染人胚肾成纤维细胞系,经zeocin筛选获得真核稳定表达细胞株;采用RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因的转录和翻译,并检测表达上清中hLIF因子对人白血病细胞HL-60的生物学活性。结果PCR产物电泳后于609 bp处见特异性条带。双酶切出现两条带,其中位于609 bp处可见相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的hLIF基因的CDS序列完全一致。RT-PCR结果显示表达细胞中存在hLIF基因转录,ELISA结果测定表达上清中hLIF的浓度为110.134 pg/ml。结论携带hLIF基因的重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF构建成功,并且获得了稳定表达hLIF基因的人胚肾成纤维细胞株,这为此基因的临床应用和实验研究打下了基础。
- 苗莉郁心谢宇锋盛伟华杨吉成刘铁连单云波井莹莹胡志清缪竞诚
- 关键词：逆转录病毒载体基因重组真核表达
- CD34^+造血干/祖细胞在转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞中的扩增及其移植SCID小鼠的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察对CD34+造血干/祖细胞的扩增作用,并研究移植辐射损伤模型SCID小鼠的效果。方法:建立转hLIF基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果,建立辐射损伤模型SCID小鼠,将扩增后的CD34+造血干/祖细胞经CFDASE荧光标记后移植入SCID小鼠体内,通过RT-PCR和观察荧光标记细胞来检测小鼠内的人源细胞。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞纯度可达(95.6±2.58)%,与饲养层细胞共培养后CD34+造血干/祖细胞可扩增13.2倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,移植入SCID小鼠四周后,仍可见带有荧光标记的人源细胞,RT-PCR证明人源基因Alu的存在。结论:建立的转hLIF基因腺病毒载体饲养层细胞可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且有较高的移植效率和造血活性。
- 井莹莹杨吉成缪竞诚盛伟华胡志清郁心单云波刘铁连韩亚丽包婉蓉张日朱南康
- 关键词：腺病毒载体SCID小鼠
- 转基因饲养层细胞体外促进脐带血CD34^+ HSPC增殖
- 2009年
- 目的构建转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,观察其对脐带血CD34+HSPC的扩增作用。方法用分子生物学技术建立转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,免疫磁珠法分离脐带血CD34+HSPC,将其与饲养层细胞共培养7 d后,流式细胞术检测其增殖,将扩增后染色的CD34+细胞移植入SC ID小鼠体内,应用荧光显微镜和RT-PCR法观察移植效果。结果CD34+HSPC与饲养层细胞共培养后扩增了9.4倍,其表面归巢相关分子CXCR4和CD54阳性率仍较高,植入小鼠体内4周后,可成功归巢到小鼠骨髓。结论建立的转hOSM基因饲养层细胞可以有效地扩增CD34+HSPC,并维持其较高的移植效率和造血活性。
- 胡志清杨吉成盛伟华井莹莹苗莉张日朱南康缪竞诚
- 关键词：反转录病毒载体
- 细胞因子治疗^(60)Coγ射线照射所致急性放射病的实验研究被引量：2
- 2009年
- 目的观察重组人白细胞介素-11(rhIL-11)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)联用对60Coγ射线照射所致急性放射病的疗效。方法16只比格狗随机分为对照组(5只)、对症治疗组(5只)和细胞因子治疗组(6只)。所有动物均接受4.5Gy60Coγ射线照射,并在照后当天开始治疗,对症治疗组仅给予积极的对症支持治疗,细胞因子治疗组在对症治疗的基础上,加用rhIL-11和rhG-CSF,对照组不给予任何治疗。观察动物的一般情况、外周血象、外周血有核细胞早期凋亡率和坏死率、血浆中细胞因子含量及组织病理学变化。结果细胞因子治疗组动物的45d存活率升高,外周血象也明显改善;外周血有核细胞早期凋亡率和坏死率明显降低;外周血血浆中IL-2和IFN-γ含量在早期均升高,随后IL-2迅速下降,IFN-γ含量相对比较稳定;骨髓组织病理学结果显示造血功能明显恢复。结论rhIL-11和rhG-CSF联用可促进急性放射病比格狗的造血和免疫功能恢复,是治疗急性放射病的有效方法。
- 胡志清张学光王修珍井莹莹朱南康张日缪竞诚
- 关键词：急性放射病重组人白细胞介素-11重组人粒细胞集落刺激因子
- Ang-1和VEGF165腺病毒的载体构建及其表达
- 目的:构建人血管生成素-1(Ang-1)和人血管内皮生长因子VEGF165(VEGF165)的腺病毒载体,为下一步用Ang-1和VEGF165转基因细胞修饰丝素材料进行动物创伤恢复实验研究奠定基础。
方法:通过...
- 刘铁连谢宇锋盛伟华缪竞成单云波胡志清井莹莹杨吉成
- 关键词：血管生成素-1腺病毒载体RT-PCR法血管形成
- 文献传递
- 抑瘤素M的研究进展被引量：1
- 2008年
- 胡志清缪竞诚
- 关键词：抑瘤素M黑色素瘤细胞淋巴瘤细胞培养上清液白细胞介素U937
- Ad-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达
- 2010年
- 目的 构建poly（A）-Promoter介导的携带人肿瘤生长抑制因子4（ING4）和人白细胞介素-24（IL-24）双基因的重组腺病毒共表达载体Ad-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24（简称Ad-ING4-IL-24）,研究Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长的影响.方法 以含有poly（A）和Promoter （hEF1-eIF4g）基因片段的pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR扩增poly（A）-Promoter目的 片段（含Sal Ⅰ,Not Ⅰ）,亚克隆至pAdTrack-CMV载体中以构建pAdTrack-CMV-poly（A）-Promoter空载体,再分别以pcDNA3.0-ING4和pcDNA3.0-IL-24重组质粒为模板,PCR扩增ING4（含BglⅡ,Sal Ⅰ）和IL-24（含XhoⅠ,XbaⅠ）目的 基因片段,并依次插入pAdTrack-CMV-poly（A）-Promoter载体中构建pAdTrackCMV-ING4-Poly（A）-Promoter-IL-24双基因共表达重组转移载体,测序正确后用Pme Ⅰ酶线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24,再经Pac Ⅰ酶线性化后用脂质体转染QBI-293A包装细胞,经多轮扩增后收获Ad-ING4-IL-24重组腺病毒子,其效价可达3.5×109PFU/ml,用RT-PCR和Western blot法分别鉴定ING,4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中的转录和表达,MTT法和流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长抑制和诱导细胞凋亡的功能及其增效作用.结果 DNA测序结果显示pAdTrack-CMV转移载体中插入的ING4、poly（A）-Promoter和IL-24序列与GenBank报道的完全一致,RT-PCR和Western blot检测结果显示Ad-ING4-IL-24能成功介导ING4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中表达 并能明显抑制HepG-2人肝癌细胞的生长和诱导其凋亡,其中Ad-ING4-IL-24双基因组更优于相应各单基因组.结论 成功构建了poly（A）-Promoter介导的Ad-ING4-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体,Ad-ING4-IL-24不仅能明显抑制HepG-2人肝癌细胞生长和诱导其凋亡,而且与Ad-ING4和AdIL-24单基因组相比具有抑癌增效作用.
- 盛伟华谢宇锋缪竞诚顾范博单云波刘铁连井莹莹胡志清杨吉成
- 关键词：生长抑制因子4IL-24肿瘤基因治疗
- 腺病毒载体介导的ING4基因对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用被引量：9
- 2009年
- 目的:用人源化改造的鼠肿瘤生长抑制因子(mING4)基因构建的腺病毒表达载体(Ad-ING4)研究对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用。方法:以pcDNA3.0-mING-4重组质粒为模板,通过基因定点突变技术对mING4基因进行人源化改造,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人ING-4氨基酸序列相同的重组腺病毒子(Ad-ING4),感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING4在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞技术检测ING4基因表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;荧光共聚焦显微镜观察MG-63细胞凋亡的形态学变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因表达对MG-63细胞中的Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果:基因测序和PCR分析结果显示,人源化改造的小鼠ING4分子氨基酸序列与人ING4分子完全相同,成功构建了Ad-ING4腺病毒表达载体,在MG-63细胞中ING4基因的表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,出现典型细胞凋亡形态学变化,ING4基因表达可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡。结论:转染ING4基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2表达水平来发挥抗肿瘤作用的。
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- 关键词：ING4基因腺病毒载体凋亡
- Ad—hLIF转基因饲养层细胞对CD34^＋造血干／祖细胞增殖和分化的影响
- 2009年
- 目的用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因（Ad—hLIF）感染WT-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞，体外观察转基因细胞对CD34^＋造血干／祖细胞增殖和分化的影响，体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法用RT—PCR和ELISA法鉴定Ad—hLIF转基因饲养层细胞目的基因的表达后，将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34^＋细胞在饲养层和／或细胞因子培养体系中扩增28d，检测不同时问点的单个核细胞（MNC）数量及CD34^＋细胞阳性率；扩增后的MNC经CFDASE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内，RT—PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的归巢情况。结果感染50MOI（multiplicityofinfection）Ad·hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光，RT—PCR和ELISA法结果显示hLIF日的基因能在WI-38饲养层细胞中表达，免疫磁珠法分离的CD34^＋造血干／祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95．60％±2．58％，MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增，最高可达356．95±0．87倍，其中CD34^＋细胞仅在0～14d能维持较高水平，最高可扩增52．11±1．13倍，以后逐渐降低。将其移植辐射损伤SCID小鼠后，可明显提高小鼠存活率，4周内小鼠骨髓中不仪可观察到CFDASE荧光标记的细胞，而凡经RT．PCR法鉴定后，还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论成功建立的Ad—hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34^＋造血干／祖细胞，并延缓其分化。扩增的CD34^＋细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能。
- 井莹莹杨吉成盛伟华胡志清郁心单云波刘铁连韩亚丽包婉蓉张日朱南康缪竞诚
- 关键词：腺病毒载体SCID小鼠
