汪伟
- 作品数：13 被引量：16H指数：3
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划四川省科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明还公开了乙脑/黄热嵌合病毒及其应用，以及一种预防黄热病的疫苗。本发明嵌合病毒Chimeri-JYF的毒性小，免疫保护作用好...
- 杨会强汪伟何婷刘莉娜赵宇刘俐曾献武
- 登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2013年
- 目的构建登革病毒1型(DENV-1)E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应(PCR)扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta(DE3)感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。
- 汪伟丁显平杨会强李竹石谭帅赵宇刘莉娜谭昌耀曾献武
- 关键词：登革病毒原核细胞
- 手持拉曼光谱技术在乙型脑炎减毒活疫苗生产用辅料检定中的应用被引量：2
- 2020年
- 目的分析采用拉曼光谱技术对乙型脑炎减毒活疫苗生产用辅料进行快速鉴别的可行性。方法使用拉曼光谱仪对乙型脑炎减毒活疫苗不同批次、不同规格生产用关键辅料(蔗糖、乳糖、尿素、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠)进行扫描。对同一辅料不同部位多次采集,建立相应拉曼光谱方法和图谱库,并用以上辅料进行性能确认。选择与乙型脑炎减毒活疫苗生产用辅料化学结构类似的物质(葡萄糖和二水合磷酸二氢钠)进行专属性验证。结果用手持式拉曼光谱仪对乙型脑炎减毒活疫苗生产用关键辅料进行检测,在分析中未发现偏差,采集的样品图谱与标准图谱一致,与《中国药典》四部(2015版)鉴别结果一致。检测与乙型脑炎减毒活疫苗生产用辅料化学结构类似、性状相近的物质则显示失败,表明拉曼光谱仪建立的方法准确,专属性强,仪器性能可靠。结论拉曼光谱鉴别方法符合相关法规要求,可用于乙型脑炎减毒活疫苗生产用辅料的快速鉴别检测。
- 谢姗姗李欣朱晓艳张杜鹃赵青汪伟
- 关键词：拉曼光谱仪乙型脑炎减毒活疫苗辅料
- 无小鼠神经毒力的乙型脑炎病毒／登革病毒1型嵌合病毒的筛选与序列分析
- 2018年
- 目的采用蚀斑纯化法筛选对小鼠无神经毒力的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）／登革病毒（denguevirus，DENV）1型嵌合病毒（JD1）纯化株，分析影响JD1小鼠神经毒力的相关位点。方法将JD1在乳地鼠。肾细胞中进行3轮蚀斑纯化，检测JD1纯化株对小鼠的脑内神经毒力。然后提取无神经毒力纯化株的基因组RNA，用逆转录PCR分段扩增全基因组序列并进行序列测定。将测序结果分别与原DENV-1的前膜-包膜蛋白和JEV骨架病毒株SA-14-14-2的基因序列进行比对。选取2个无神经毒力纯化株进行小鼠免疫保护实验。采用单侧￡检验对结果进行比较。结果经过3轮蚀斑纯化后，获得大、中、小3种蚀斑形态的6个JD1纯化株。3个纯化株对小鼠无神经毒力，小鼠脑内注射后全部存活；1株神经毒力较弱，70％以上小鼠存活；2株具有强神经毒力，小鼠全部死亡。测序结果显示，对小鼠无神经毒力的3个纯化株存在2处相同的氨基酸突变。将其中2个纯化株JD1-PP-61和JD1-PP-31腹腔免疫小鼠后，再用1000半数致死量DENV-1鼠脑适应株进行脑内攻击。JD1-PP-61能较好地保护小鼠抵抗病毒攻击，仅20．0％小鼠死亡（t=7．237，P〈0．001）；JD1-PP-31保护效果稍弱，41．9％小鼠死亡（t=4．752，P〈0．01）。结论通过蚀斑纯化筛选出对小鼠无神经毒力的JD1纯化株，并发现了可能与神经毒力减弱相关的位点。
- 何婷范凤鸣牟建超杨欢刘莉娜刘俐汪伟曾献武杨会强
- 关键词：登革热病毒脑炎病毒神经毒力
- 登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性
- 2014年
- 目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ,转化至E.coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价。用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力。结果重组原核表达质粒p ET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37%;纯化的纯度可达90%以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1%的小鼠免受致死剂量DENV的攻击。结论成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力。本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础。
- 汪伟李竹石谭帅赵宇刘莉娜刘俐蔡峰曾献武杨会强
- 关键词：登革病毒E蛋白原核细胞免疫原性免疫保护力
- 乙脑/登革4型嵌合病毒的构建及其小鼠神经毒力测定
- 2019年
- 目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。
- 孙艳汪伟刘莉娜范凤鸣杨会强刘杰曾献武
- 关键词：神经毒力
- 乙型脑炎减毒活疫苗病毒群体的异质性分析被引量：2
- 2015年
- 目的通过观察疫苗病毒群体中病毒个体的遗传和生物学特征，分析SA14-14—2株乙型脑炎减毒活疫苗病毒的均一性，为疫苗病毒的遗传稳定性提供实验证据。方法对3批疫苗病毒连续进行3次蚀斑纯化后，各挑选8个蚀斑纯化株，扩大培养一代。比较24个病毒纯化株的包膜（envelope，E）蛋白基因序列、单斑培养病毒滴度以及蚀斑特征。结果24个纯化株中共有6个病毒株（25％）的E蛋白核苷酸发生变化，其中2株（8．3％）的核苷酸变异导致其编码氨基酸发生改变，这些变异占总核苷酸变异数的28．6％。动物实验表明，这2个纯化株没有引起小鼠神经毒力变化。在所有24个纯化株中，我国2010年版药典规定的影响疫苗病毒遗传稳定性的8个E蛋白关键位点的氨基酸均未发生改变。24个纯化株病毒的蚀斑大小和形态以及单斑培养滴度均无明显差异。结论疫苗病毒具有典型的准种群体多样性特征，但在群体病毒中未检测到E蛋白氨基酸位点为野生型病毒位点的个体病毒，因此，疫苗病毒具有很好的减毒群体特征和遗传稳定性。
- 杨会强汪伟刘莉娜何婷曾献武
- 关键词：脑炎病毒遗传异质性
- 乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响被引量：6
- 2013年
- 目的:探索乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸(E279)MK回复突变(M279K)对其毒力的影响。方法:用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含有SA14-14-2包膜蛋白M279K突变的全长cDNA质粒pACNR-JEV(M279K),并以其为模板体外转录RNA,将RNA电转染导入BHK21细胞得到恢复病毒rJEV(M279K),并比较恢复病毒和疫苗病毒在蚀斑大小以及对小鼠神经毒力等方面的差别。结果:酶切及测序表明质粒模板成功构建,除人为引入的突变外(碱基1813处T→A),无任何碱基突变,并发现rJEV(M279K)形成比疫苗株更小的蚀斑,但毒力与疫苗株无显著差异。结论:E279回复突变影响乙脑疫苗SA14-14-2病毒蚀斑大小,但并未明显增强疫苗株对小鼠的神经毒力。
- 杨健李玉华李竹石林华汪伟刘丽娜倪谦枝曾献武杨会强
- 关键词：乙型脑炎病毒疫苗回复突变
- 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了乙脑/黄热嵌合病毒及其应用，以及一种预防黄热病的疫苗。本发明嵌合病毒Chimeri‑JYF的毒性小，免疫保护作用好...
- 杨会强汪伟何婷刘莉娜赵宇刘俐曾献武
- 文献传递
- shRNA沉默猪白细胞介素-10及其受体基因对PRRSV复制和免疫应答的影响
- 引言猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是动脉病毒属的一种高致病性单链RNA病毒,给全球的养猪产业带来了巨大的损失。研究表明PRRSV诱导白细胞介素-10(IL-10)增加而抑制机体抗病毒免疫应答,是它感染致病的重要机理...
- 王晔陈义辉汪伟万小平肖永乐高荣
- 关键词：藏猪短发夹RNA
