刘威龙
- 作品数：7 被引量：7H指数：2
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- SLC7A11基因表达沉默的肝癌细胞株的构建及筛选被引量：1
- 2015年
- 目的:构建并筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌LM3细胞株,为研究SLC7A11基因的表达沉默对肝癌发生发展的影响奠定基础。方法:针对SLC7A11基因的不同部位合成3个siRNA的寡核苷酸片段,分别将其克隆到真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中。利用脂质体转染法分别将质粒导入肝癌LM3细胞,24小时后观察细胞内GFP表达情况,并通过real-time PCR及Western blot的方法比较各组细胞SLC7A11基因mRNA和蛋白的表达水平,然后用G418对转染细胞进行筛选培养。结果:经酶切分析及测序验证,成功构建了靶向沉默SLC7A11基因的真核表达质粒p GPU6-SLC7A11-siRNA;通过real-time PCR及Western blot的方法验证,成功筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌LM3细胞株。结论:成功构建并筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌细胞株,为进一步研究SLC7A11基因表达沉默对肝癌细胞发生发展的影响奠定了基础。
- 吴伟刚田圆刘琢冰刘妙娜刘威龙杨桂林陈心春周伯平
- 关键词：肝癌细胞细胞株
- BLCAP基因RNA过编辑对肝癌细胞增殖的影响被引量：1
- 2016年
- 目的研究BLCAP基因RNA过编辑对肝癌SMMC7721、Focus细胞的生长增殖能力的影响,并探讨其在肝癌发生发展的作用。方法采用半定量PCR的方法分析BLCAP基因在11株肝癌细胞以及2株正常肝脏细胞中的表达情况,选出2株BLCAP基因相对低表达的肝癌细胞株。以基因转染技术,将空质粒(pc DNA3.1,对照组)、BLCAP_WT(野生型)和BLCAP_RDD(过编辑型)质粒(实验组)分别转染肝癌细胞株,通过Western blot法检验转染效率。利用CCK-8生长曲线试验和平板克隆形成实验检测肝癌细胞株的增殖能力。结果半定量PCR结果显示BLCAP基因在肝癌SMMC7721、Focus细胞中的表达量相对较低。Western blot的结果显示,实验组细胞BLCAP基因的蛋白表达水平较对照组细胞明显增高(P<0.05),表明转染较成功。CCK-8生长曲线试验和平板克隆形成实验的结果显示,肝癌SMMC7721和Focus细胞在转染BLCAP_RDD质粒后,其增殖能力较空质粒对照组及BLCAP_WT组细胞明显增强(P<0.05)。结论 BLCAP基因过编辑可促进肝癌SMMC7721和Focus细胞的增殖,提示其在肝癌细胞中的过编辑与肝癌的发生发展密切相关。
- 刘琢冰吴伟刚刘妙娜刘威龙杨桂林陈心春周伯平
- 关键词：BLCAP基因肝癌细胞增殖
- 三种PCR方法在HBV基因整合位点确定中的应用比较被引量：1
- 2010年
- 目的 比较反向PCR（Inverse-PCR,IPCR）、Alu-PCR、接头PCR（Cassette-ligationmediated-PCR,CLM-PCR）三种PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）方法在乙型肝炎病毒基因组（HBV DNA）整合位点筛选中的应用效果.方法 手术获取1例乙肝表面抗原（HBsAg）阳性的肝癌患者的肝癌组织,提取基因组DNA,设计相应引物,分别采用三种PCR方法进行扩增,将PCR产物回收,克隆至PMD18-T载体进行基因测序,利用BLAST工具进行序列比对,分析三种方法在乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合位点确定中的效果.结果 采用Inverse PCR方法检测PCR产物后得到7个特异性电泳条带,克隆后得到测序结果22个,经序列比对发现3个整合位点;采用Alu-PCR方法,产物电泳得到13个特异性条带,得到测序结果32个,序列比对未发现整合位点;采用CLM-PCR方法,得到12个特异性电泳条带,得到测序结果4个,未发现整合位点.结论 在查找HBV整合位点的研究中,IPCR方法具有较稳定的扩增能力及较高的位点检测率.
- 王兰天祝葆华周伯平刘威龙廖明凤李晓鹤陈心春李涛
- 关键词：聚合酶链反应病毒整合
- 氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响被引量：2
- 2015年
- 目的:研究氨基葡萄糖对人肝癌Hep G2细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其分子机制。方法:CCK-8法检测人肝癌Hep G2细胞的增殖情况。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。Western blot检测ERK及P-ERK蛋白的表达水平。结果:氨基葡萄糖可以抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖,且该作用随着药物浓度的增加而逐渐增强。1.0mmol/L氨基葡萄糖作用72h可以使G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低。同时,2.0mmol/L及4.0mmol/L氨基葡萄糖处理72h可以使人肝癌Hep G2细胞发生凋亡。另外,随着药物浓度的增加,人肝癌Hep G2细胞中ERK蛋白的磷酸化水平逐渐降低。结论:氨基葡萄糖可能是通过降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平影响细胞周期,从而抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。
- 吴伟刚刘威龙诸葛福艳田圆刘琢冰陈心春周伯平
- 关键词：氨基葡萄糖肝癌细胞HEPG2增殖凋亡
- 硒蛋白S过表达载体的构建及其在肝癌细胞SMMC7721中的表达鉴定
- 2014年
- 目的构建硒蛋白S基因(SELS)真核表达载体pCMV-SELS,转染肝癌SMMC7721细胞,实现SELS在SMMC7721中的成功过表达。方法通过基因克隆技术将SELS基因的完整ORF插入真核表达载体pCMV-3tag-3a(+),得到阳性真核表达质粒pCMV-SELS,将其瞬时转染到肝癌SMMC7721细胞中,利用RT-PCR与Western blot方法验证SELS的过表达水平。结果成功构建了真核表达质粒pCMV-SELS,将其瞬时转染SMMC7721细胞后24 h,收集细胞进行RT-PCR和Western blot检测,结果显示:与阴性对照组pCMV-3tag-3a(+)转染组相比,实验组pCMV-SELS细胞中SELS的mRNA和蛋白表达水平均有显著升高,两组比较具有统计学差异(P<0.05)。结论成功构建真核表达载体pCMV-SELS,并实现了SELS基因在SMMC7721细胞中的过表达。
- 吴繁刘威龙周伯平艾书玲陈心春祝葆华
- 关键词：过表达肝癌细胞
- CENPK基因过表达载体的构建及鉴定被引量：2
- 2015年
- [目的]构建着丝粒蛋白K(cetromere protein K,CENPK)基因过表达载体,并对其在肝癌FOCUS细胞中的表达进行鉴定。[方法]1从人肝癌组织中扩增出CENPK目的基因并将其克隆到p CMV-3Tag-3载体上,构建真核表达载体p CMV-CENPK;2利用脂质体法将构建好的p CMV-CENPK真核表达载体转染肝癌FOCUS细胞,并用G418筛选出CENPK基因稳定过表达的肝癌FOCUS细胞株;3通过Real-time PCR及Western Blot的方法对筛选出来的细胞进行鉴定。[结果]1经双酶切分析及测序验证,成功构建了真核表达载体p CMV-CENPK。2通过Real-time PCR及Western blot的方法鉴定,CENPK基因在筛选出来的肝癌FOCUS细胞株中成功过表达。[结论]成功构建真核表达载体p CMV-CENPK并使其在肝癌FOCUS细胞中稳定过表达,为进一步研究CENPK基因在肝癌发生发展中的作用奠定了基础。
- 吴伟刚刘妙娜刘利平刘琢冰刘威龙陈心春周伯平
- 关键词：过表达真核表达载体
- 结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E.coli中的高效表达
- 2010年
- 目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6)。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入E.coliBL21(DE3),阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis.BindResins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。
- 李兵刘威龙张晶张明霞邓群益李晓鹤罗瑞玲余卫业陈心春周伯平
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达
