赵桂梅
- 作品数：4 被引量：1H指数：1
- 供职机构：北京大学临床肿瘤学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人uPA基因克隆和单克隆抗体的制备及其在乳腺癌中表达的检测被引量：1
- 2009年
- 目的克隆人尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)基因,制备和鉴定针对人uPA的单克隆抗体,检测uPA在乳腺癌中的表达。方法利用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞MDA231总RNA中扩增克隆uPA基因,构建可表达uPA蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达GST-His-uPA融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合及次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养,并进行三次亚克隆筛选出单克隆细胞株,制备腹水,纯化单克隆抗体。用Western blot、免疫组织化学等方法检测了uPA在乳腺癌中的表达。结果克隆了1 227 bp的uPA基因片段,构建了可表达uPA蛋白的原核表达质粒pET-41b-uPA;获得了3株能稳定分泌针对uPA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类均为IgG2a,它们均能特异识别uPA,与其它蛋白无交叉反应。Western blot结果显示,该抗uPA单抗与GST-His-uPA融合蛋白及细胞中的天然uPA蛋白均能结合。免疫组织化学显示,该单抗在乳腺癌低侵袭低转移细胞系MCF7中呈阴性表达,而在乳腺癌高侵袭高转移细胞系MDA231中呈阳性表达,并且能与乳腺癌组织结合,呈强阳性反应。结论克隆了人uPA基因,通过原核表达体系制备并纯化了针对uPA的单克隆抗体,初步检测了uPA在乳腺癌细胞和组织中的表达,为深入研究uPA的功能和检测临床肿瘤组织及体液中的uPA奠定了可靠的基础。
- 赵桂梅张青云王雅明徐建军
- 关键词：尿激酶型纤溶酶原激活物单克隆抗体乳腺癌免疫组织化学
- 抗人uPA鼠源单克隆抗体的制备及其在肿瘤中表达的检测
- 目的:尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase -type plasminogen activator,uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶,存在于正常细胞和肿瘤细胞,它可降解细胞外基质及基底膜,在肿瘤的的发生、发展中起重要...
- 张青云赵桂梅王雅明徐建军
- 关键词：尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体免疫细胞化学肿瘤侵袭
- 文献传递
- 抗人肝癌相关基因LAPTM4β胞内肽段单克隆抗体的制备与鉴定及其表达的检测
- 2009年
- 目的制备和鉴定鼠抗人肝癌相关基因溶酶体相关四次跨膜蛋白β胞内99个氨基酸残基(LAPTM4β-IC-N1-99)的单克隆抗体,检测LAPTM4β在肝癌中的表达,为深入研究其结构和功能奠定基础。方法利用本实验室构建原核表达质粒pGEX-KG-LAPTM4β-IC-N1-99,在大肠杆菌中表达融合蛋白GST-LAPTM4β-IC-N1-99。用纯化的蛋白LAPTM4β-IC-N1-99免疫雌性BALB/C小鼠,以常规杂交瘤技术制备鼠抗人LAPTM4β-IC-N1-99单克隆抗体(LAPTM4β-IC-N1-99McAb)。进行抗体亚类测定和免疫印迹法(WB)分析,然后用免疫化学技术检测LAPTM4β-IC-N1-99在肿瘤中的表达。结果诱导并纯化了重组GST-LAPTM4β-IC-N1-99蛋白,其相对分子质量约为32000;纯化得到LAPTM4β-IC-N1-99蛋白,其相对分子量约为10000。筛选出6株能稳定分泌抗LAPTM4β-IC-N1-99单克隆抗体的杂交瘤细胞株(D7,B12,H2,H8,A9和A10),D7、H8、A10分泌抗体亚类为IgG1,B12、A9、H2为IgG2b。Western blotting鉴定显示,抗LAPTM4β-IC-N1-99单抗可与融合蛋白及细胞内LAPTM4β蛋白特异性结合,具有高度特异性。免疫细胞化学证明,所得抗体能检测到肿瘤细胞中LAPTM4β基因的表达。结论以纯化的LAPTM4β-IC-N1-99蛋白免疫,获得了效价高、特异性好的LAPTM4β-IC-N1-99蛋白的单克隆抗体,用其可检测到LAPTM4β肿瘤细胞中的表达,这为LAPTM4β蛋白的生物学功能研究奠定了基础。
- 张瑞娟李琦张青云王雅明徐建军赵桂梅
- 关键词：单克隆抗体杂交瘤
- 尿激酶型纤溶酶原激活物在不同侵袭转移潜能乳腺癌细胞表达中的差异
- 2009年
- 目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）在3种乳腺癌细胞中表达的差异性及其意义。方法分别用逆转录（RT）-PCR、荧光定量（FQ）-PCR、免疫印迹法（WB）和免疫细胞化学技术检测3个细胞系（乳腺癌低度侵袭转移细胞系MCF7、中度侵袭转移细胞系MDA231和高度转移细胞系BICR-H1）中uPA在mRNA、蛋白水平的差异表达。结果经RT-PCR检测uPA结果显示，内参基因GAPDH在3种细胞系MCF7，MDA231，BICR—H1中的表达量相近，uPA基因在细胞系MCF7，BICR—H1中的表达未被检出，在MDA231细胞系中的表达有明显的227bp条带；经FQ-PCR检测uPA基因结果显示，细胞系MDA231中uPA基因的交叉点值（CrossPoint，Cp值）为31．51，在细胞系BICR—H1和MCF7中uPA基因的cp值相近，分别为36．93和36．73；WB和免疫细胞化学方法对蛋白水平检测显示，uPA蛋自在乳腺癌3个细胞系中的表达情况为BICR—HI〉MDA231〉MCF7（增强化学发光的灰度比为4．7：3．15：1）。结论乳腺癌细胞系中uPA蛋白的表达水平与细胞侵袭转移能力相关，检测uPA蛋白水平有可能成为今后乳腺癌病情监测及预后判断的重要指标。
- 赵桂梅张青云刘俊泽王雅明徐建军
- 关键词：肿瘤转移尿纤溶酶原激活物逆转录聚合酶链反应免疫印迹法
