丁兰
- 作品数：4 被引量：27H指数：3
- 供职机构：四川大学华西医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究被引量：20
- 2005年
- 用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中RNAi作用的剂量和时间效应.应用Lipofectamine 2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)的质粒共转染HEK293H细胞,观察shRNA载体对报告基因的抑制效应.转染后,shRNAs的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达.在共转染后12,24,48,60,72,96 h时检测EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因mRNA及蛋白质表达水平,结果显示,EGFPmRNA及蛋白质表达在12 h时略有降低,24～48 h时表达逐渐降低,48～72 h时降低最明显,其后EGFP表达水平逐渐恢复.提示该过程中RNAi效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势.共转染一系列剂量比例的EGFP干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内,RNA干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一'平台期'.此外,通过RNAi抑制HeLa细胞、HEK293细胞中荧光素酶基因的表达,荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应.这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的RNAi作用呈现剂量和时间依赖性效应.这为基于载体表达的RNAi技术应用研究提供了一定的理论参考及依据.
- 何国平张思仲王英成肖翠英马用信许文明丁兰陶大昌孙岩陈玉娟
- 关键词：RNA干扰短发夹RNA报告基因共转染
- 与成人多囊肾病PKD2基因紧密连锁的四种微卫星DNA在中国汉族人群中的多态性被引量：5
- 2002年
- 目的 分析与成人多囊肾病 PKD2基因紧密连锁的 4种微卫星 DNA D4S15 34、D4S15 6 3、D4S42 3和 D4S414在中国汉族人群中的多态性 ,为该病的异质性研究奠定基础。方法 采用聚合酶链反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术对部分无血缘关系的中国汉族人的上述 4个微卫星 DNA进行了多态分析。结果 在中国汉族人群中 ,D4S15 34、D4S15 6 3、D4S42 3和 D4S414的等位片段分别有 11种、14种、17种和 15种 ,其等位片段大小分别为 142～ 16 2 bp、2 0 5～ 2 35 bp、10 3～ 135 bp和 2 36～ 2 6 4bp,多态信息量分别为 0 .872、0 .844、0 .92 1和 0 .871。结论 在研究的中国汉族人群中 ,D4S15 34、D4S15 6 3、D4S42 3和D4S414这 4种微卫星有较多的等位片段 ,均是高度多态的遗传标记 ,为人类群体遗传学提供了数据 ,表明这 4种微卫星可用于成人多囊肾病的遗传异质性的研究、连锁分析、法医学个体鉴定和亲权鉴定。
- 丁兰孙岩张思仲周宏远彭艳
- 关键词：成人多囊肾病PKD2基因微卫星DNA
- 一个可能与PKD2基因连锁的常染色体显性多囊肾病家系被引量：3
- 2005年
- 目的研究常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)在中国人中的遗传异质性。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测了1个ADPKD家系各成员中与PKD1基因连锁的4种和与PKD2连锁的4种微卫星标记的基因分型。然后以软件辅助构建单倍型,并推测疾病单倍型。结果发现该ADPKD家系中,与PKD1紧密连锁的4个微卫星KG8、SM6、CW4和CW2是有信息的;与PKD2基因紧密连锁的3种微卫星DNA D4S1563、D4S414和D4S423是有信息的。推定的单倍型提示,在这个家系中疾病可能与PKD2连锁,而不与PKD1连锁。结论在此家系中,受累成员间存在表型异质性,并且有一个早发的儿童患者。与PKD2连锁的家系较少,这个家系的报道表明中国人中存在ADPKD的遗传异质性,PKD2的异常也可能会引起中国人ADPKD的发生。另外,发现有遗传早现现象存在,且疾病通过母亲传递。这提示在与PKD1不连锁的家系中后代可能早发病。
- 孙岩丁兰王有麒周宏远张思仲
- 关键词：PKD2基因基因连锁常染色体显性多囊肾病聚合酶链反应
- 短发夹RNA介导RNA干涉的实验学控制研究
- 2005年
- 采用载体介导的RNA干涉 (RNA interference,RNAi)技术抑制HEK293H细胞中外源报告基因的表达,并设置一系列的实验学控制以探讨其在RNAi应用研究中的价值及意义.运用pAVU6+27,构建了针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的一系列短发夹RNA表达载体,并用脂质体法转染于HEK293H细胞中,检测EGFP mRNA及蛋白表达水平.瞬时转染48h后, RT-PCR及Western blot结果表明,针对EGFP三个靶点的干涉质粒均不同程度地抑制细胞内EGFP的表达,但仅转录正反义链、链内1-2个碱基错配的干涉载体不能介导特异的RNAi效应.此外,共转染实验结果表明干涉质粒两两间无相互增强或抑制的RNAi效应.在此基础上,通过G418筛选生成了HEK293H EGFP稳定表达株,在转染后不同时间点检测EGFP mRNA及蛋白表达变化,发现RNAi 效应在一定时间范围内呈现明显的时间依赖性.这些结果表明,有效的实验控制在RNAi研究中十分必要,具有重要的参考价值.基于载体表达的RNAi作用呈现明显的时间依赖性效应,为RNAi应用研究提供了一定的参考及借鉴价值.
- 何国平张思仲马用信肖翠英许文明孙岩丁兰张炜陶大昌陈玉娟
- 关键词：短发夹RNA介导EGFPRNA干涉碱基错配
