吴竞
- 作品数：10 被引量：60H指数：4
- 供职机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目北京市科技新星计划更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备被引量：10
- 2019年
- 本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP 402 R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP 402 R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP 402 R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。
- 任肖吴竞于海男林伟东侯绍华侯绍华郭晓宇
- 关键词：EP原核表达多克隆抗体
- 非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立被引量：28
- 2018年
- 为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。
- 吴竞王西西吴映彤任肖郭晓宇
- 关键词：P30基因原核表达间接ELISA
- 布鲁氏菌A、M因子血清的研制
- 2014年
- 研制牛种布鲁氏菌A因子血清和羊种布鲁氏菌M因子血清，用于光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。将灭活牛种布鲁氏菌2308株及羊种布鲁氏菌16M株免疫1．5～2 kg家兔各5只制备高免血清。对高免血清采用抗原交叉吸附的方法，制得A、M因子血清，分装冻干后置-20℃保存。微量试管凝集试验结果显示：研制的A因子血清对16M抗原在1∶2．5时无凝集现象，对2308抗原凝集价为1∶320；研制的M因子血清对2308抗原在1∶2．5时无凝集现象，对16M抗原凝集价为1∶160。玻片凝集试验结果显示：研制的A、M因子血清对异种抗原无凝集现象。试验表明，研制的A、M因子血清具有特异性强、效价高的特点，可辅助光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。
- 张金亚程君生冯宇丁家波王楠皮向成吴竞张东东朱良全毛开荣
- 关键词：布鲁氏菌
- 检测牛IFN-γ双抗体夹心ELISA的建立及在牛结核病诊断上的初步应用被引量：3
- 2014年
- 本研究旨在建立牛IFN-γ体外释放法,为牛结核病的免疫学诊断提供一种快速、有效的新检测技术。分别以获得的牛IFN-γ单克隆抗体Bo-mAb1作为捕获抗体,以Bo-mAb2H作为检测抗体,建立了基于双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)的牛IFN-γ体外释放法。该方法的最低检出限为3.12ng·mL-1,可特异性检测出重组牛IFN-γ(Bac-BoIFN-γ)及天然BoIFN-γ,而与猪、犬、鸡的天然IFN-γ无交叉反应。批内、批间变异系数小于5.11%。临床检测结果显示,与结核菌素皮内变态试验(TST)、进口BovigamTM试剂盒检测的符合率分别为88.7%和95.3%。结果表明,DAS-ELISA法具有良好的敏感性、特异性及精确度,可用于临床样品的检测,为监测牛结核病特别是其早期感染提供了强有力的检测技术手段。
- 张改梅贾红侯绍华鑫婷郭晓宇袁维峰刘淑清吴竞高新桃李明董瑞凯朱鸿飞
- 关键词：牛结核病IFN-Γ双抗体夹心ELISA
- 非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：11
- 2018年
- 本研究旨在采用原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1毒株毒力基因UK,获得重组蛋白(DP96R),进一步制备并鉴定DP96R重组蛋白的多克隆抗体。首先构建原核重组表达质粒pET-28a-UK并转化BL21感受态细胞,在16℃、0.4 mmol/L IPTG条件下诱导10 h后,检测到目的蛋白以可溶性表达为主,蛋白分子量约为15 kDa。然后采用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗DP96R蛋白多克隆抗体。ELISA结果表明制备的多抗具有良好反应性,Western blot和免疫荧光实验(immunofluorescence assay,IFA)表明制备的多抗能特异性识别真核表达的DP96R蛋白。DP96R重组蛋白及多克隆抗体的制备为进一步研究DP96R蛋白的生物学功能以及建立ASFV毒株鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。
- 王西西吴映彤吴竞陈鸿军陈鸿军郭晓宇
- 关键词：非洲猪瘟病毒原核表达多克隆抗体
- 牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价被引量：2
- 2015年
- 为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。
- 李明贾红鑫婷郭晓宇袁维锋侯邵华侯强高新桃吴竞董瑞凯杨宏军刘来兴朱鸿飞
- 关键词：牛分枝杆菌原核表达牛结核病诊断
- 非洲猪瘟病毒多基因家族成员MGF360-12L RPA检测方法的建立被引量：7
- 2020年
- 为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。
- 吴映彤王西西吴竞陈鸿军陈鸿军朱鸿飞
- 关键词：非洲猪瘟病毒RPA
- 牛分枝杆菌TB9.8蛋白的表达及其诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞因子的分泌
- 2014年
- 为研究牛分枝杆菌TB9.8蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长及分泌细胞因子的影响,本研究将编码牛分枝杆菌TB9.8蛋白的基因克隆于pET-30a质粒中并在E.coli中进行表达。经SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白(rTB9.8)约9.8 ku,具有良好抗原性。以不同剂量的纯化rTB9.8刺激巨噬细胞RAW264.7,采用动态实时细胞检测技术分析rTB9.8对RAW264.7生长影响的最佳时间点和最佳剂量,结果表明rTB9.8可以在8 h^24 h对RAW264.7细胞的增殖产生明显的抑制作用。此外,rTB9.8能够显著诱导RAW264.7细胞表达TNF-α、IL-6和IL-12。本实验为进一步研究牛分枝杆菌rTB9.8与宿主细胞相互作用提供了实验依据。
- 刘淑清贾红侯绍华鑫婷袁维峰郭晓宇张改梅高新桃李明吴竞董瑞凯朱鸿飞
- 关键词：牛分枝杆菌细胞因子
- 2308、M28、S1330、16M四株布鲁氏菌灭活参数研究被引量：2
- 2015年
- 【目的】比较不同灭活方法对布鲁氏菌灭活的效果,确定灭活参数,为制备布鲁氏菌灭活抗原提供参考。【方法】将4株布鲁氏菌参考强毒株2308(牛种)、M28(羊种)、S1330(猪种)以及16M(羊种)分别经大豆酶消化蛋白胨(TSA)培养基培养繁殖后,用生理盐水制成(4-8)×1010 CFU/m L的菌悬液,分成等份于80 oC灭活不同时间,另将同样浓度的菌悬液分别用不同浓度甲醛于37 oC灭活不同时间,通过灭活检验,确定灭活效果。取经甲醛和热灭活的16M抗原,分别以1×1010 CFU/只剂量皮下注射1.5-2.0 kg家兔2只,免疫6周内,每周采血用虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)测定抗体效价。【结果】80 oC、5 min可灭活2308、S1330和16M三种菌株,80 oC、10 min可灭活全部4种菌株。0.2%甲醛灭活7 d,4种试验菌株均不能被彻底灭活;0.4%甲醛在12 h内只能灭活16M,72 h可灭活M28;0.4%甲醛灭活2308和S1330两次试验结果差异较大。0.6%甲醛可在72 h内灭活4种试验菌。不同方法灭活的16M抗原免疫家兔后,其血清抗体虎红平板凝集和试管凝集效价消长趋势基本一致,甲醛灭活的抗原免疫原性略高于热灭活抗原。【结论】80 oC热灭活和0.6%甲醛灭活均可用于对布鲁氏菌的灭活,且不影响布鲁氏菌的免疫原性。
- 朱良全王芳吴竞冯宇张金亚王楠朱鸿飞丁家波
- 关键词：布鲁氏菌灭活甲醛
- 2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病性分析被引量：4
- 2017年
- 为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为HP-PRRSV,将其分别命名为PRRSV CZ16A和NP16A。为研究PRRSV分离株CZ16A和NP16A对猪的致病性,将分离毒株经噬斑纯化后分别接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄健康仔猪,通过临床观察、解剖病理变化及病毒血症检测等指标初步探讨两株PRRSV的致病性。结果表明,分离株CZ16A和NP16A感染猪后均能够在动物体内复制,并引起体温升高,但两株PRRSV分离株均未引起试验动物的发病和死亡,剖检结果显示NP16A分离株能引起动物肺部实变、淋巴结肿大,其毒力比CZ16A分离株稍强。
- 李志隋修锟吴竞鑫婷李明高新桃姜一曈侯绍华
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
