单雪峰
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院感染性疾病分子生物学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 结构特异性核酸酶FEN1对HBV复制的影响被引量：2
- 2012年
- 目的探索宿主因子FEN1对HBV复制过程的影响。方法构建FEN1过表达慢病毒质粒,酶切鉴定并测序,转染293FT细胞,Western blot检测FEN1蛋白表达。将该质粒转染HBV复制稳定细胞系,设立慢病毒包装改造质粒pLenti6/V5-D-TOPO和不转染质粒的细胞作为对照。ELISA检测细胞上清,Southern blot及Real-time PCR检测HBV DNA。结果初筛阳性克隆提取质粒酶切鉴定,于FEN1及线性载体质粒大小处出现明亮单一条带,测序结果表明序列插入正确,Western blot检测FEN1蛋白表达量为对照的2～3倍。FEN1过表达质粒转染HBV复制稳定细胞株,细胞上清ELISA检测HBsAg抗原呈阳性,D(450)值为(1.982±0.032);细胞内提取病毒DNA行Real-time PCR,绝对定量拷贝数为1.18×109,Southern blot检测亦表明HBV复制水平明显上调。结论结构特异性核酸酶FEN1能够明显促进HBV DNA复制,是体内一种重要的病毒复制调控因子。
- 潘万龙方岩许舸单雪峰徐蕾陈可黄爱龙胡接力
- 关键词：慢病毒载体乙型肝炎病毒病毒复制
- 应用肽核酸反向杂交技术检测HBV阿德福韦耐药突变株被引量：1
- 2014年
- 目的:建立一种肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)反向杂交技术,用于检测乙肝病毒阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)常见耐药突变位点。方法:利用反向杂交技术,设计出特异性的PNA探针,与PCR扩增后带有生物素标记的样本进行杂交;通过对探针浓度,杂交温度和时间等条件的优化建立起最佳反应条件。应用该技术检测了临床ADV治疗慢性乙肝患者的72例血清样本,与测序法比较了其检测的准确性。结果:(1)通过共价结合能够将PNA探针固定在尼龙膜上,特异性检测ADV常见耐药突变位点。(2)与直接测序法相比,PNA反向杂交技术检测准确性为97.88%。结论:通过优化杂交反应,建立起快速、灵敏的检测乙肝病毒ADV常见耐药突变位点的PNA反向杂交技术。
- 单雪峰谢素兰黄爱龙胡源
- 关键词：肽核酸反向杂交阿德福韦酯
- 瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定
- 2013年
- 目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。
- 潘万龙方岩许舸单雪峰徐蕾陶颖黄媛胡接力
- 关键词：真核细胞基因表达
