刘志刚
- 作品数：32 被引量：87H指数：6
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 克服位置效应提高外源基因在CHO细胞中稳定高效表达的策略被引量：3
- 2006年
- 能够生产有功用的治疗性蛋白的一个重要前提是获得稳定的重组蛋白高表达细胞株,然而筛选一个能够持续稳定表达外源蛋白的重组细胞株是费时费力的过程。有多篇文献报道了重组蛋白细胞株表达的不稳定性。位置效应是高表达细胞株不稳定性的重要因素,克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径。为解决外源基因插入的随机性所带来的不可预知的后果,可以事先在CHO细胞基因组中筛选转录热点区域,再通过位点特异性或同源重组的方式,实现外源基因的定点整合。各种调节位置效应的DNA元件陆续被发现,可以利用它们去调控基因表达及增加细胞株的稳定性。
- 周宏刘志刚俞炜源
- 关键词：CHO细胞稳定性重组蛋白
- CHO/dhfr^-细胞定点整合高效表达系统的建立被引量：6
- 2007年
- 为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。
- 周宏刘志刚孙志伟俞炜源
- 关键词：CHO细胞重组蛋白
- 抗降解的IIn-UK融合蛋白在CHO细胞中的高表达研究
- 为了研制对血栓特异的新型导向溶栓制剂,本实验室在以前的工作中,利用噬菌体表面呈现技术,筛选到一株对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟, 得到亲和力和特...
- 林建波刘志刚杜韫王双俞炜源
- 文献传递
- A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与应用
- 本发明公开了一个A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与其在制备A型肉毒毒素疫苗中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID NO：...
- 俞炜源余云舟孙志伟刘志刚王双
- 文献传递
- 基于CHO细胞定点整合技术的新型抗体呈现系统的构建
- 2012年
- 目的建立一个以CHO定点整合系统为基础的高通量抗体筛选平台,筛选获得抗VEGF高亲和力突变体抗体。方法设计并构建了基于CHO细胞定点整合系统的通用minibody展示载体,将3株亲和力已知的抗VEGF抗体(A6,A63,A657)和1个抗VEGF轻链抗体库分别呈现在CHO细胞的表面,通过Western印迹、Bia-core3000、流式细胞分析等对该展示系统进行验证和评价,并通过流式细胞分选技术对抗体库进行了细胞筛选。结果成功实现了抗VEGF抗体在CHO细胞表面的展示,流式细胞分析抗体的亲和力与Biacore测定全抗体亲和力结果一致;通过筛选获得3株抗VEGF高亲和力突变体抗体。结论建立了基于CHO定点整合技术的新型抗体库展示系统,为抗体的亲和力成熟、分子改造等突变库的构建和筛选提供了新的技术支持。
- 何阳阳刘敏李春张畅孙志伟刘志刚王双庞晓斌
- 关键词：抗体库CHO细胞高通量筛选
- 小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化被引量：1
- 1999年
- 目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体，并初步分析比较两者的体外生物活性。方法：经ＤＮＡ重组构建重组表达质粒，经ＩＰＴＧ诱导，在大肠杆菌中高表达两种单链抗体，用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物，并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６，纯化的表达产物经复性后用ＥＬＩＳＡ检测其活性。结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上，经变性、纯化后纯度可达９７％，而且两种复性后的纯化产物具有相似的抗原结合特性。结论：小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体都能在大肠杆菌中实现高表达。
- 刘志刚俞炜源黄君健
- 关键词：纤维蛋白单链抗体基因表达纯化
- 哺乳动物细胞高效表达载体的优化被引量：2
- 2006年
- 目的:优化哺乳动物细胞表达系统,提高目的基因的表达效率。方法:以组织型纤溶酶原激活剂(tPA)为报告基因,利用本实验室建立的CHOfrt/dhfr-细胞定点整合表达系统,对多种表达调控元件(包括hCMV和hEF-1α启动子、hCMV增强子、hEF-1α1st内含子及翻译增强子H213和V163等)及其多种组合的表达效率进行了系统的比较和评价。结果:hCMV启动子与H213组合以及hEF-1α启动子与V163组合的表达效率分别是仅含hCMV启动子的156.6%和139.5%。结论:该研究为构建高效的哺乳动物细胞表达载体奠定了基础。
- 张国强刘志刚刘珊俞炜源
- CHO细胞高效表达载体的优化被引量：2
- 2006年
- 目的:研究分析中国仓鼠EF1-α基因的转录调控序列,以构建新型高效表达载体。方法:利用常规分子生物学技术,构建了一系列基于CHEF1-α基因的非翻译区调控序列元件的新型真核表达载体。以组织型纤溶酶原激活剂突变体(k2tPA)作为报告基因,利用本室已建立的CHO-dhfr--Z+定点整合表达系统比较载体表达外源基因的能力,挑选表达量高的载体。进一步添加翻译增强子(H213及V163)序列,再进行评价。结果:CHEF1-α5′UTR及启动子+3′UTR 1.65 kb、CHEF1-α5′UTR及启动子+3′UTR 2.7 kb这2种组合均可有效提高目的基因tPA的表达,表达效率与对照载体相比分别提高了65.9%和54.5%。在添加翻译增强子V163后,载体pMCEdEF53Ⅲ-163 frt-k2 tPA的表达效率为对照载体的2.65倍。结论:该载体系统在重组蛋白药物的研发方面具有良好的应用前景。
- 刘珊刘志刚张国强俞炜源
- 关键词：基因表达组织型纤溶酶原激活物
- 新型噬菌体表面呈现载体的构建被引量：5
- 2002年
- 作为抗体库筛选的一个有效方法,噬菌体表面呈现技术在单链抗体的研制中得到广泛的应用。以噬菌粒pCANTAB5E和pHB为基础,利用PCR和DNA重组方法,构建了一个新型的用于单链抗体噬菌体表面呈现的噬菌粒载体。随后用一株对大肠杆菌细胞有毒性的人源化单链抗体(1HSCFV)对其呈现单链抗体的效果进行了初步的评价,结果表明新型噬菌粒系统具有更好的呈现能力。
- 刘志刚俞炜源林建波
- 关键词：单链抗体噬菌体表面呈现
- 鼠抗人纤维蛋白单链抗体的二次人源化及人源化抗体的体外成熟
- ScFvA11是该实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到一株对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体,而且以该鼠抗体为基础,构建和表达了单链抗体-低分子量尿激酶融合基因.动物试验表明,在达到相同的溶栓效果时,单链抗体-尿激酶融合蛋白的用...
- 刘志刚
- 关键词：人源化抗体单链抗体体外成熟抗体库噬菌体呈现
- 文献传递
