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人VDAC2融合蛋白质粒构建及原核表达研究: 2008年; 目的:构建人VDAC2融合蛋白原核表达质粒并进行原核表达研究。方法:运用RT-PCR技术在培养的人HepG2.2.15细胞中钓取到目的基因VDAC2,连接至T载体上进行克隆,获得大量目的基因与原核表达载体pTrc-CKS、pMBP-P连接,构建重组融合蛋白表达质粒,转入大肠杆菌中DH5α,BL21(DE3)LySs中,IPTG诱导蛋白原核表达,表达产物经SDS-PAGE检测,分析蛋白表达情况。结果:成功构建了重组载体pTrc-CKS-VDAC2和pMBP-P-VDAC2,并在原核大肠杆菌中实现了重组融合蛋白的超量表达。结论:构建的两个人VDAC2的融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中均得到超量表达。为进一步研究VDAC2蛋白奠定了基础。; 董国法丁道芳王燕菲; 关键词：原核表达

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定: 2006年; 目的构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶。方法用PCR扩增CAD基因,将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体。经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体。经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带。经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用。结论成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂。; 章喜明王燕菲; 关键词：原核表达

针对HBV S基因mRNA反义锁核酸设计及其在2.2.15细胞内的抗病毒作用被引量：8: 2009年; 目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因翻译起始区反义锁核酸(LNA)片段在HepG22.2.15细胞内抗病毒效果及有效LNA序列筛选.方法:设计合成互补于HBVS基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15细胞,采用ELISA法和FQ-PCR法分别监测24、48和72h细胞培养上清液中HBsAg和HBVDNA的含量;MTT法检测LNA对细胞代谢的影响.结果:4条不同序列长度(10、15、20及25个碱基)的反义LNA对HBsAg的表达和HBVDNA的复制均有显著性抑制作用,72h后的抑制率分别为46.58%、54.38%、72.43%、69.92%及27.09%、28.77%、34.71%、32.68%,且抑制率随时间呈增高趋势.LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对HBVS基因mRNA翻译起始区的反义LNA短序列体外能显著抑制HBV基因的表达,且抑制作用最强的序列长度应在15-25个碱基之间.; 邓益斌王燕菲; 关键词：锁核酸 2.2.15细胞

乙型肝炎病毒感染模型应用新进展被引量：1: 2008年; 邓益斌王燕菲; 关键词：乙型肝炎病毒转基因技术

阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性研究被引量：3: 2008年; 目的:探讨阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性。方法:采用流体动力学法,经尾静脉给小鼠注射不同剂量的阳离子脂质体,对照组注射等量5%GLU液。于注射前、注射后第1天和第3天,经眶静脉采血,用自动血球计数仪测定外周抗凝血中的白细胞(WBC)、淋巴细胞(LY%)、中性粒细胞(GR%)。用自动生化分析仪测定血浆中的清蛋白(Alb)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)。同时做脏器组织切片HE染色,观察肝、肾脏组织结构的变化。结果:与对照组比较,12μl/g剂量以上组的WBC、BUN、CR均明显升高(P<0.05),ALT、Alb无显著性差异(P>0.05)。12μl/g剂量以下组无明显变化(P均>0.05)。与注射前比较,注射后第1天,WBC、BUN、CR显著升高(P<0.05),而注射后第3天除CR外均基本恢复正常(P>0.05)。而ALT、Alb无显著性差异(P>0.05)。肝肾脏组织切片HE染色,各荆量组间组织结构变化无差异。结论:阳离子脂质体对小鼠外周血相和肾脏功能的毒性作用呈剂量和时间依赖性,故使用其作为核酸药物载体用于基因治疗研究时,剂量应小于12ul/g体重,给药时间应隔1天以上。; 邓益斌秦爱萍朱晓莹王燕菲; 关键词：脂质体基因治疗药物载体毒性

反义锁核酸与拉米夫定在HepG2.2.15细胞中抗HBV作用的比较: 2011年; 目的:应用反义锁核酸与拉米夫定作用HepG2.2.15细胞,对他们抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)效果进行比较.方法:设计针对HBV翻译起始区S基因mRNA的反义寡核苷酸,并进行锁核酸修饰,以阳离子脂质体介导反义锁核酸转染HepG2.2.15细胞;拉米夫定组直接作用HepG2.2.15细胞;分别于用药后第2、4、6、8、10天收集细胞培养上清液.用ELISA法和FQ-PCR法检测收集上清液HBsAg、HBeAg和HBVDNA的含量.MTT法分别检测反义锁核酸与拉米夫定对细胞存活率的影响.结果:拉米夫定对HBVDNA具有明显抑制作用,最高可达46.52%,但对HBsAg、HBeAg影响较小;反义锁核酸对HBsAg、HBeAg及HBVDNA均有较强抑制作用,对HBsAg、HBeAg和HBVDNA的最高抑制率分别达67.69%、59.71%和62.96%(P<0.05),且抑制随时间呈增高趋势.反义锁核酸与拉米夫定对细胞代谢均无明显影响.结论:反义锁核酸抗HBV作用机制与拉米夫定不同,反义锁核酸抗HBV作用明显优于拉米夫定.; 朱晓莹王燕菲; 关键词：乙型肝炎病毒拉米夫定 HEPG2.2.15细胞抗病毒

HBV S基因反义锁核酸抑制病毒体外复制被引量：12: 2010年; 目的探讨乙型肝炎病毒S基因反义锁核酸(LNA)片段在HepG22.2.15细胞内的抗病毒效果及有效LNA片段筛选。方法设计合成互补于HBVS基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15细胞株,采用ELISA法和实时荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)分别监测24、48和72 h细胞培养上清液中HBsAg和HBV DNA的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞代谢。结果4条不同序列长度反义LNA均显著抑制HBsAg表达和HBVDNA复制,72 h后最高抑制率分别达72.43%和34.73%。HBsAg分泌量和HBV DNA的拷贝数均明显低于对照组(P<0.01)。LNA对细胞代谢无明显影响。结论针对HBVS基因mRNA翻译起始区的反义LNA片段体外能显著抑制HBV表达,且抑制作用最强序列长度在15～25个碱基之间。; 邓益斌张梁王燕菲; 关键词：锁核酸 HEPG2 2.2.15细胞阳离子脂质体

麦芽糖通道蛋白的晶体结构揭示跨膜运输过程中对糖分子选择性通透的机理: 大肠杆菌外膜的麦芽糖通道蛋白可选择性的通透麦芽糖及寡聚麦芽多糖,而对其他二糖如蔗糖,乳糖等则通透率很低.本研究通过X-射线单晶衍射得到了高分辨率的麦芽糖通道蛋白的三维结构,并根据其分; 王燕菲; 文献传递

针对HBVS基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探被引量：10: 2006年; 目的探讨针对HBVS基因翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片断体外抗乙型肝炎病毒表达的作用。方法合成三段均互补于HBVS区同一位点的反义核酸片断:锁核酸、反义寡核苷酸、全硫代反义寡核苷酸及无关对照序列,作用于HepG22.2.15细胞,采用ELISA法动态检测细胞上清中HBsAg含量的变化并比较其抗HBV抗原表达作用,以四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测LNA对细胞的毒性。结果三段反义寡核苷酸均能抑制HBsAg的表达,作用7d后抑制率分别为52%、42%、45%,其中LNA抗病毒活性最强且对细胞代谢无影响,无关序列无明显抑制作用。结论针对HBVS区的锁核酸体外能有效抑制乙型肝炎病毒的表达,为乙肝的分子治疗开辟了新的前景。; 唐盈王燕菲; 关键词：锁核酸寡核苷酸类反义 2.2.15细胞

构建pCool-GST-ICAD/CAD并在大肠杆菌中表达CAD核酸酶及活性研究: 2006年; 目的:构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶。方法:用PCR扩增CAD核酸酶基因,将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达质粒。经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果:构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达质粒,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体,经分离纯化后得到纯度很好的CAD/ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带,经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶活性。结论:成功构建具有生物学活性的CAD核酸酶,有助于进一步研究细胞凋亡的作用机制。; 章喜明王燕菲; 关键词：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

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王燕菲

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