田辉
- 作品数：7 被引量：27H指数：4
- 供职机构：东北农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：哈尔滨市科技创新人才研究专项资金黑龙江省教育厅资助项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嗜中性粒细胞是人抵抗素表达的主要细胞被引量：5
- 2011年
- 抵抗素(resistin)是小鼠白色脂肪组织大量表达的富含半胱氨酸的分泌型蛋白.近年研究发现,人与啮齿类动物的抵抗素组织表达分布存在很大差异.小鼠抵抗素主要在白色脂肪组织表达,而人抵抗素主要在单核细胞/巨噬细胞表达,且在骨髓组织中大量表达,但目前骨髓中的细胞定位还不清楚.本研究的目的是明确成人骨髓及外周血白细胞中抵抗素表达细胞的类型.免疫荧光法检测骨髓中抵抗素表达细胞,结果显示,抵抗素主要表达在细胞核呈杆状和分叶核状的成熟粒细胞中,其中杆状核粒细胞表达较高,分叶核粒细胞表达减弱.Anti-hresistin IgG-Biotin-PE单色荧光流式细胞术分选外周血白细胞中抵抗素表达细胞后经瑞氏化学染色,结果显示,抵抗素表达细胞主要为杆状和分叶核状的嗜中性粒细胞,还有少量嗜酸性粒细胞,且抵抗素蛋白分布在细胞质中.RT-qPCR结果在RNA水平上证明,人抵抗素在嗜中性粒细胞中大量表达.Anti-hresistin IgG-FITC和anti-HNL IgG-Biotin-PE双色荧光流式细胞术进一步证明,抵抗素的主要表达细胞为成熟的嗜中性粒细胞.嗜中性粒细胞在机体免疫防御中起重要作用,人骨髓及外周血中抵抗素主要在成熟嗜中性粒细胞中表达,这一研究结论为人抵抗素与炎症反应的关联性及其功能的进一步研究奠定了基础.
- 高振秋张巧徐彤田辉任桂萍李璐刘向宇李德山
- 关键词：骨髓外周血嗜中性粒细胞
- 基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立被引量：2
- 2013年
- 目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗体的重链可变区和轻链可变区基因,然后利用重叠PCR的方法构建得到抗-hIL-1βscFv抗体。将scFv抗体插入到NlpA leader-pHEN1表达载体中构建成展示scFv的重组质粒pBSD-scFv。将pBSD-scFv转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果所展示的抗-hIL-1βscFv抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBSD-scFv-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论经过该细菌展示系统展示的scFv抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异结合能力。
- 徐黎明任桂萍尹杰超田辉李德山
- 重组新城疫病毒rNDV-IL15在黑色素瘤治疗中的效果被引量：3
- 2014年
- 为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL15。构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线;rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL15的表达量;MTT法比较rNDV-IL15和rNDV在体外抑制B16F10细胞的效果,并比较了两者在黑色素瘤肿瘤模型中对荷瘤小鼠的治疗效果。结果表明,rNDV-IL15构建并成功拯救;病毒生长曲线表明,插入IL15后对病毒的生长无影响;IL15在细胞上清液中有较高的表达,达到(1 044.3±27.7)ng·mL-1;rNDV-IL15和rNDV对B16F10细胞的抑制率呈时间依赖性,但两者的抑制率无显著差异;与rNDV相比,rNDV-IL15在体内能较明显地抑制肿瘤生长。结果提示,rNDV-IL15是一种更有效的抗肿瘤制剂。
- 牛泽杉白福良孙田田辉尹杰超曹宏伟于丹田贵游吴云舟李德山任桂萍
- 关键词：重组新城疫病毒黑色素瘤B16F10抗肿瘤制剂
- 利用SUMO表达系统高效可溶表达人白细胞介素15及其活性研究被引量：3
- 2013年
- 目的:探讨重组人白细胞介素15(rhIL-15)的表达条件、纯化工艺并进行生物活性鉴定。方法:采用RT-PCR方法从正常成人外周血淋巴细胞中扩增出人白细胞介素15(hIL-15)cDNA,克隆到pSUMO Vector中,构建rpSUMOhIL-15重组质粒。将转化重组质粒的工程菌诱导表达,超声破碎后取菌液上清,经过亲和层析、酶切、亲和层析得到成熟蛋白。高效液相色谱进行纯度分析;利用rhIL-15促进T细胞增殖、rhIL-15诱生的NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力鉴定其生物活性;荷瘤鼠实验研究rhIL-15抗肿瘤作用。结果:经纯化后得到rhIL-15,其分子量大小为14.4 kD,蛋白纯度在95%以上,具有显著刺激T细胞增殖和NK细胞杀伤肿瘤细胞效果。动物实验结果显示其具有明显的抗肿瘤作用。结论:经过纯化获得高纯度和高生物学活性的rhIL-15,且具有明显增强NK细胞杀伤、刺激T细胞增殖和抗肿瘤的活性,为细胞因子联合其他方法治疗肿瘤等疾病提供了实验基础。
- 白福良田辉牛泽杉于引航王文飞周兵李德山
- 关键词：融合蛋白T细胞增殖NK细胞杀伤活性抑制肿瘤作用
- 筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立被引量：7
- 2011年
- 目的:利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术,为今后抗体的研发工作奠定基础。方法:从pNAD质粒中克隆出NlpAleader(含有CDQSSS序列)基因序列,利用相应的酶切位点将该序列插入pComb3表达载体中构建成用于展示Fab的重组质粒pBFD。将从pEAI质粒克隆得到的anti-human IL-1β抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NlpAleader和pelBleader(pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游。将pBFD-Fab转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果:所展示的anti-hIL-1β Fab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBFD-Fab-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论:经过该细菌展示系统展示的Fab抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异性结合能力。成功改进该展示技术的基因拯救方法,避免了基因突变和链置换的发生。此外还证明了该展示技术具有很好的稳定性。本实验成功构建了筛选Fab抗体库的细菌展技术。
- 徐黎明尹成凯任桂萍田辉王雪琴丁良君李德山
- 关键词：FAB抗体库
- 酵母展示筛选scFv方法的建立被引量：7
- 2009年
- 目的:利用酵母展示技术建立筛选scFvs的技术平台,为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础。方法:改造pYD1载体,将其自身所带的GSLinker上下游两端突变出酶切位点,构建成pYD-x;分别将IL-1β抗体的重链与轻链可变区片段插入pYD-x中GSLinker的上下游,构建出重组质粒pYSD1。从pYSD1上PCR扩增出scFv片段,并将其插入pYD1的MCS区,构建出重组质粒pYSD2。将pYSD1与pYSD2分别转入酿酒酵母EBY100中诱导表达scFv,并用流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况。结果:经诱导后,从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY100-pYSD1所展示的scFv与抗原结合力很弱,而EBY100-pYSD2则表现出一定强度的结合。结论:本实验证明了pYD-x载体上存在的额外的GSLinker对于抗体展示的必要性,并且成功建立了利用酵母展示载体pYD1进行scFvs筛选的技术平台。
- 尹成凯徐黎明任桂萍张巧刘向宇田辉李德山
- 关键词：SCFVGSLINKER
- 错配PCR技术提高抗hIL17A单链抗体亲和力的研究被引量：5
- 2012年
- 目的:通过错配PCR技术提高1株人源化抗hIL17A单链抗体(scFv)的亲和力,为进一步开发治疗类风湿性关节炎(RA)的人源化抗体药物奠定基础。方法:本研究采用错配PCR和重叠PCR的方法,对抗体的重链、轻链可变区分别随机引入突变,并将细菌内膜展示技术和流式细胞技术(FCM)相结合进行高通量筛选,获得高亲和力突变株。由于hIL17A能刺激HeLa细胞产生白细胞介素IL-6和IL-8,因此scFv突变株经表达纯化后,利用real-time PCR技术在mRNA转录水平上检测其阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力。结果:筛选出5株突变株,经流式细胞仪检测其中有3株亲和力与亲本相比有很大程度的提高,2株与亲本相当,而且所有突变株均保留了亲本与hIL17A的结合能力,经real-time PCR检测证明这5株突变株均有阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力,突变株的亲和力与中和效果成正比。结论:错配PCR技术是抗体体外亲和力提高的一种可行性方法,在保证与抗原结合能力的基础上提高了其亲和力和中和活性。该实验结果为RA的靶向治疗提供了候选药物,而且也为抗体的体外亲和力的提高提供了参考方法。
- 田辉白福良徐黎明王文飞牛泽杉任桂萍李德山
- 关键词：FCMREAL-TIMEPCR单链抗体
