南京大学生命科学学院分子医学研究所
- 作品数：40 被引量：123H指数：7
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- 发文基金：国家科技重大专项江苏省科委自然科学基金教育部科学技术研究重点项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生轻工技术与工程化学工程更多>>
- 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定被引量：3
- 2004年
- 利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a/K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌.经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%.该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性.
- 陈于红朱镇华刘蓓钫张菁傅一工王石泉张巍杨庆刘建宁
- 关键词：工程菌质粒稳定性克隆
- 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究被引量：2
- 2004年
- 将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究.
- 朱镇华孙自勇陈于红张菁王石泉杨庆刘莉莉丁楅森陈新园刘建宁
- 关键词：发酵活化纯化蛋白
- rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定
- 2004年
- 将重组人酸性蛋白水解酶原 (rh_proBACE)基因克隆到原核表达载体 pET2 8a质粒中 ,构建了pET2 8a_rh_proBACE重组表达载体 ,并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达 .包涵体中的表达产物溶于 6mol/L盐酸胍 ,经Ni_Sepharose亲和层析纯化后 ,得到高纯度的rh_proBACE蛋白 .将此蛋白在复性液中重新折叠后 ,于酸性条件 (pH 4.5)下激活 ,切去酶原序列 ,产生有活性的rhBACE蛋白 ,并利用人工合成多肽底物 (BAS_1 31 )
- 郭志刚张巍陈新园傅一工孙自勇刘建宁
- 关键词：克隆活性测定Β分泌酶阿尔茨海默病BACE
- 大鼠缺血下肢血管新生过程中人血管内皮细胞生长因子165和人血管形成素的协同效应被引量：2
- 2004年
- 目的:观察肌肉转染腺病毒(adenovirus,Ad-)携带的人血管内皮细胞生长因子-165(vascularendothelialgrowfactor,Ad-VEGF165)和人血管形成素-1(angiopoietin-1,Ad-Ang-1)基因对大鼠缺血下肢的生血管效应。方法:用SD雄性大鼠84只,分为7个组,每组12只,分别为正常组、假手术组、结扎组、绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)组(作为病毒对照组)、Ang1组、VEGF165组、Ang1+VEGF165组。制作大鼠下肢血管闭塞模型,肌肉内注射Ad-VEGF165或/和Ad-Ang-1,以Western法检测生长因子蛋白表达、免疫组化检测基因导入后在缺血肌肉引起的效应。结果:①肌肉经注射Ad-VEGF165和Ad-Ang1后高表达人VEGF165蛋白和人Ang1蛋白。②术后7d处理组与对照组新生毛细血管数目无明显差别。但术后14d和21dAng1和VEGF165组的毛细血管/骨骼肌纤维数目比明显高于对照组(F=24.53,P<0.01),VEGF165+Ang1两因子合用组明显高于单用组(F=12.22,P<0.01)。③VEGF165组及VEGF165+Ang1合用组出现大量包围着一厚层平滑肌肌动蛋白α(smoothmuscleactin,α-SMA)阳性平滑肌细胞的血管,其数量与肌肉数比值明显高于对照组(F=9.73,P<0.01)。④因子单用组和合用组肌肉内出现大量BrdU阳性细胞浸润,部分细胞表面呈现C-Kit阳性。
- 宋建蓉杨志健张馥敏马文珠李玉华哈团柱李传富高翔
- 关键词：血管新生内皮生长因子基因疗法
- 重组人尿激酶原（pro—UK）的长期毒性
- 2001年
- 方泰惠陈于红等
- 关键词：重组人尿激酶原长期毒性
- 人血管生成素-1和血管内皮生长因子_(165)基因克隆及复制缺陷型腺病毒载体构建被引量：8
- 2003年
- 周磊张馥敏杨志健陆丽丁兆丰丁必森哈团柱李传富高翔马文珠
- 关键词：人血管生成素-1血管内皮生长因子165基因克隆基因复制腺病毒载体
- 重组人尿激酶原(pro-UK)的长期毒性
- 重组人尿激酶原(recombinant single chainurokinase type plasminogen activator,rscu-PA,即pro-UK)是利用DNA重组技术制备的具有纤维蛋白选择性的强效...
- 方泰惠张培祥徐立罗炳辉杨世华陈于红张菁刘建宁
- 文献传递
- 尿激酶体外抑制人体免疫缺损病毒的侵染能力(英文)
- 2005年
- 人体免疫缺损病毒的包膜蛋白gp120的V3环区包含一段在人类蛋白质中很少出现的高度保守序列,但这段序列与纤溶酶原被纤溶酶原激活剂酶切位点附近序列有同源性.由于V3环区在人体免疫缺损病毒侵染细胞过程中的重要性,评估了尿激酶对人体免疫缺损病毒侵染能力的影响.通过检测逆转录酶活力,P24抗原的表达和合胞体形成情况发现尿激酶可以抑制人体免疫缺损病毒对多种淋巴瘤和白血病细胞系,如MT4、CEM、H9和外周血单核细胞的侵染能力,并且这种抑制与尿激酶浓度呈剂量依赖关系.那些能够被尿激酶抑制的人体免疫缺损病毒株其V3环区序列必须与纤溶酶原激活区序列同源,实验室常用病毒株包括BRU和RF以及某些野生病毒株.研究结果显示尿激酶在体外实验中可以抑制人体免疫缺损病毒的侵染能力.
- 刘建宁张德正Carole LeContel陈平Victor Gurewich张菁陈新园
- 关键词：尿激酶GP120纤溶酶原人体免疫缺损病毒
- 重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定(英文)
- 2005年
- 刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( +)中构建重组表达质粒pET25b ( +)/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.
- 马志峰孙自勇陈均勇刘建宁
- 关键词：胰蛋白酶瑞替普酶纤溶酶
- 氨甲环酸与Wnt信号通路中含kringle结构域蛋白的结合对新生小鼠骨密度的影响(英文)
- 2005年
- 最近研究发现Wnt信号通路在骨形成过程中发挥重要作用.Wnt受体如脂蛋白相关蛋白5(lrp5)和孤独受体(Ror2)的缺失或突变导致骨的不正常发育.Dkk是一个分泌型规范Wnt信号系统的抑制剂,通过与脂蛋白相关蛋白5和最近新发现的一种含kringle结构域的蛋白kremen形成三聚体复合物.这种复合物随即被细胞内吞,从而导致细胞表面Wnt受体脂蛋白相关蛋白5水平迅速下降,从而达到抑制Wnt信号通路的目地.通过对kremen和Ror2蛋白序列分析发现kremen和Ror2的胞外部分均含有一个结构上能与赖氨酸结合的kringle结构域.通过给怀孕母鼠注射一种赖氨酸类似物———氨甲环酸来研究kremen和Ror2的kringle结构域上的赖氨酸结合位点被占据对小鼠骨发育的作用.但是,研究结果表明AMCA组和对照组之间的骨密度并没有显著差异,揭示赖氨酸结合位点不参与骨的发育调控.
- 陈新园张菁苏艺晶汪向民刘建宁
- 关键词：WNT骨密度KRINGLE
