国家自然科学基金(30100080)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 肝细胞永生化逆转录病毒载体pLTSN的构建
- 2005年
- 目的构建含猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)的逆转录病毒永生化载体pLTSN,为肝细胞永生化奠定基础。方法以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T,双粘端连接法将其克隆到pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间,通过菌落PCR和酶切法筛选、鉴定阳性克隆并经测序验证。结果用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中9个为阳性,阳性克隆经质粒DNA测序分析确证。结论成功构建了逆转录病毒永生化载体pLTSN。
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：SV40聚合酶链反应菌落
- 永生化人胎肝细胞系LC-1的建立
- 2009年
- 目的建立人源性永生化肝细胞。方法利用含有SV40T和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒表达载体pLNC-TIGlox,转染包装细胞PT67;取病毒上清液感染原代培养的人胎肝细胞,用G418筛选成功转导的永生化细胞系;用细胞计数法测定永生化细胞增殖特性,免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白表达,放免法和自动生化仪检测清蛋白和尿素氮合成功能。结果获得的一个细胞系命名为LC-1,其细胞群体倍增时间约为17h,可表达清蛋白、CK18肝细胞特征和CK19等胆管特征蛋白,具有清蛋白与尿素氮合成功能。结论成功建立了具有良好的增殖能力、分化状态、肝细胞生物学特征的永生化肝细胞系。
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：肝细胞胚胎永生化
- 生物人工肝人肝细胞系进展被引量：1
- 2005年
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：人肝细胞系生物人工肝BAL猪肝细胞肝细胞功能HEPG2
- 自身引物菌落聚合酶链反应筛选LoxP序列重组阳性克隆被引量：2
- 2004年
- 目的 研究LoxP序列小片段重组阳性克隆的筛选和鉴定方法。方法 采用合成的LoxP为上游引物,载体互补的序列为下游引物,直接以菌落为模板进行聚合酶链反应(PCR),电泳分离出784 bp的条带者为阳性;PCR阳性克隆再用酶切法进行对比鉴定及DNA测序分析确证。结果 用菌落PCR法随机筛选的6个菌落中3个为阳性,随机取1个阳性克隆进行DNA序列分析,证实含有LoxP插入序列。用酶切法对此3个阳性克隆进行鉴定,3个克隆和未进行酶切的对照均出现100 bp以下模糊带,结果不能判断。结论 自身引物菌落:PCR法用于筛选和鉴定LoxP序列重组阳性克隆是一种快速、简便、经济、高效的方法。
- 李俊刚陈耀凯王宇明
- 关键词：菌落PCR阳性克隆引物酶切法聚合酶链反应电泳分离
