广东省自然科学基金(05300465)
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
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- 慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞表达及对细胞增殖性影响的研究被引量：2
- 2011年
- 目的:建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法:制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒(Hsp90αE47A/psin-GFP),包装质粒(ΔNRF)及包膜蛋白质粒(VSV-G)。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果:转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升(为对照组的1.05±0.15倍,P<0.05,t检验),有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。(1.051±0.03vs1.349±0.05,P<0.05,t检验)。结论:成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。
- 尹强兵王晓捷马晓姣邹飞陈雪梅
- 关键词：热休克蛋白90ATP酶活性
- RNA干扰热休克蛋白90α表达对NIH-3T3细胞应激反应的影响被引量：1
- 2006年
- 目的用RNA干扰方法建立稳定的热休克蛋白90α(HSP90α)抑制表达细胞株,研究热休克蛋白90α抑制表达对细胞应激反应的影响。方法将人Hsp90αRNA干扰基因片段连接入pSilencer2.1-U6neo载体,重组质粒pSilencerHSP90经亚克隆、纯化、测序鉴定后,用电穿孔法转染到小鼠成纤维细胞系NIH-3T3细胞内。经G418筛选、克隆分离培养,用免疫荧光、免疫印迹鉴定阳性克隆。用高温作用(44℃,40min)模拟氧化应激环境,以NIH-3T3细胞为对照,流式细胞仪测定DNA受损细胞数,分析在细胞应激状态下对细胞膜和DNA的损害及HSP90低表达对细胞应激反应的影响。结果转染pSilencerHSP90的NIH-3T3细胞Hsp90免疫荧光染色减弱,主要分布于胞浆;与对照相比,44℃,40min时DNA的损害加重(9.2%vs18.5%,P<0.01)。结论建立稳定低表达HSP90αNIH-3T3细胞株;热休克蛋白90表达与其应激保护作用密切相关。
- 陈雪梅邹飞
- 关键词：HSP90RNA干扰转染
- 热应激和适应对NIH-3T3细胞蛋白质谱的影响被引量：1
- 2008年
- 目的初步分析应激与适应处理对NIH-3T3细胞蛋白质合成的影响,筛选应激适应相关蛋白。方法建立预适应细胞模型,双向电泳分离总蛋白,PDQUEST软件、肽质量指纹图谱分析候选蛋白肽段组成,观察应激与适应对细胞蛋白质合成的影响,并初步鉴定应激适应蛋白质点的类别。结果预适应后再次热应激组表达增加的蛋白质点在各相对分子质量范围均有分布,而直接热应激组中表达增加的蛋白质点大多局限于低相对分子质量范围。结论细胞在紧急应激状态,可能会倾向于选择性地合成能够迅速翻译的小分子蛋白质,应对应激损伤。预适应可通过提高细胞内保护性蛋白的贮备量,在再次应激时发挥保护作用。
- 郭进强康红云陈雪梅邹飞
- 关键词：双向电泳蛋白质组学
- Tubulin和HSP90在氧化应激预适应中的作用被引量：3
- 2009年
- 目的:探讨热休克蛋白90和细胞骨架蛋白tubulin在氧化应激预适应中的作用。方法:应用不同浓度H2O2作用于HepG2细胞,建立HSP90不同表达量的模型后,MTT比色法检测细胞活力,Western blotting定量检测各模型中HSP90、tubulin量,激光扫描共聚焦显微镜测定该两种蛋白在对照、预适应、氧化应激、预适应后氧化应激下的分布和共定位。结果:MTT比色法结果提示预适应可提高应激状态下的细胞生存活力;Western blotting结果显示氧化应激预适应可提高细胞内HSP90和tubulin含量,减轻再次应激所致的HSP90和tubulin总量下降;激光共聚焦显示该两种蛋白有相似的细胞分布。结论:Tubulin可能协同HSP90在氧化应激预适应中起保护作用。
- 康红云陈雪梅邹飞
- 关键词：微管蛋白氧化性应激
- siRNA干扰HSP90α表达对人肝癌HepG2细胞影响的研究被引量：3
- 2011年
- 目的用RNA干扰方法建立稳定的热休克蛋白90α(HSP90α)抑制表达细胞株,研究热休克蛋白90α抑制表达对人肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法将人HSP90αRNA干扰基因片段连接入pSilencer 2.1-U6 neo载体,重组质粒pSilencerHSP90经亚克隆、纯化、测序鉴定后,用电穿孔法转染到人肝癌细胞系HepG2细胞内。经G418筛选后,阳性克隆被进一步分离培养,形成稳定的HSP90α抑制表达细胞株。将此细胞株作为siRNA干扰组,将未转染的HepG2细胞作为对照组。用荧光定量PCR,免疫印迹检测siRNA对HSP90α的抑制效果,采用CCK-8法测定其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响。结果测序表明HSP90α干扰序列完全正确;siRNA干扰组HSP90αmRNA水平降低,蛋白表达量也有明显的减少;与对照组相比,siRNA干扰组在48 h后可明显抑制细胞增殖,流式细胞术检测siRNA干扰组细胞有明显的G2/M期细胞周期阻滞。结论建立稳定低表达HSP90α的HepG2细胞株;下调HepG2细胞内HSP90α的基因表达可抑制细胞增殖,引起明显的细胞周期阻滞。HSP90α靶向siRNA干扰为肝癌的基因治疗提供了可能。
- 王晓捷尹强兵马晓姣邹飞陈雪梅
- 关键词：HSP90RNA干扰HEPG2细胞
