王琪
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
- 供职机构：吉林农业大学动物科学技术学院更多>>
- 发文基金：质检公益性行业科研专项项目国家科技重大专项公益性行业(农业)科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 新孢子虫感染对大鼠主要器官病理变化的研究
- 2017年
- 为了研究动物感染新孢子虫后对各组织器官的影响,试验采用新孢子虫Nc-1株腹腔注射人工接种5周龄的SD大鼠,出现症状后分别采取肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和心脏制作常规石蜡切片,通过H.E.染色观察感染新孢子虫后各组织器官的病理变化。结果表明:显微镜下观察肝脏病理切片有淤血、坏死灶,肝细胞变性;脾脏出血;肺脏出血、淤血、水肿,肺泡壁增厚;肾脏出血,肾小管上皮细胞变性坏死;脑充血、水肿,神经元变性坏死;心肌纤维间血管充血。说明大鼠感染新孢子虫后会引起各组织器官不同程度的损伤及病理变化。
- 王琪孟庆峰王雪刘梦迪姚贵哲王伟利
- 关键词：新孢子虫SD大鼠石蜡切片病理变化
- 马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
- 2017年
- 原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。
- 王琪盖微微闫飞虎冯娜吴芳芳赵梓淇曹增国李岭迟航金宏丽邱泊宁崔健男赵永坤王铁成高玉伟王化磊杨松涛夏咸柱
- 关键词：马尔堡病毒多克隆抗体
- 扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：3
- 2018年
- 针对扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebolavirus,ZEBOV）的糖蛋白（GP）基因（158-368aa）设计引物,将PCR扩增产物克隆至原核表达载体pET30a（＋）,在宿主菌BL21（DE3）中IPTG诱导表达。对诱导条件进行优化,纯化后的蛋白通过SDS-PAGE和Western blot鉴定正确后免疫BALB/c小鼠,二免后分离小鼠血清,制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,埃博拉病毒GP在大肠杆菌中以包涵体的形式成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导6h。经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体可以识别重组杆状病毒rBacmid-GP。本研究成功表达并纯化埃博拉病毒GP,制备鼠多克隆抗体,为建立基于ZEBOV GP的检测方法和相关研究奠定了基础。
- 吴芳芳曹增国王琪迟航金宏丽冯娜赵永坤高玉伟王化磊杨松涛夏咸柱
- 关键词：埃博拉病毒原核表达多克隆抗体
- 新孢子虫核酸检测方法的建立及应用评价
- 2017年
- 以新孢子虫Nc-5基因为目的基因,建立检测新孢子虫的PCR方法并初步应用。根据Gen Bank发布的新孢子虫Nc-5特异性基因序列设计引物,以新孢子虫基因组DNA为模板,利用梯度PCR法优化反应条件,建立PCR检测方法。以弓形虫、疟原虫、牛环形泰勒虫、包拉米虫和马尔太虫为模板进行扩增以验证建立方法的特异性。采用紫外分光光度计测定新孢子虫基因组DNA浓度和纯度,倍比稀释后的DNA进行PCR扩增,产物电泳分析确定建立方法的敏感性;选择高浓度和低浓度的新孢子虫基因组DNA重复检测3次,分析建立方法的重复性和稳定性。利用该方法对实验室建立的小鼠感染模型进行初步应用,评价建立方法的检测效果。结果成功建立新孢子虫的核酸扩增检测方法,扩增序列与Gen Bank(LN714476.1)中Nc-5基因序列一致性为100%,建立的新孢子虫核酸扩增检测方法与弓形虫、疟原虫、牛环形泰勒虫、包拉米虫和马尔太虫均无交叉反应,最低能检测新孢子虫DNA浓度为0.5788 pg/μL,应用该方法检测感染新孢子虫的BALB/c小鼠模型,可在肺和脑组织中检测到新孢子虫的感染。结果表明,建立的新孢子虫核酸扩增检测方法有效,并为后续研究奠定基础。
- 马文晨李云峰王琪李萍郑夔王伟利王景林赵大力邹洪久金明华
- 关键词：新孢子虫基因小鼠PCR核酸检测
- 辽宁部分地区宠物犬犬瘟热病毒分子流行病学调查与分析被引量：5
- 2018年
- 为了解犬瘟热病毒（CDV）遗传变异情况，先后从辽宁省沈阳、锦州、辽阳等地区的9个宠物医院收治的临床疑似犬瘟热（CD）病犬中采集了165份拭子样品及组织病料。利用CD抗原检测试纸条、RT—PCR检测方式筛选到8份阳性样品。H基因序列分析结果显示该8株CDV野毒株之间的H基因同源性为97．6％-99．9％，与疫苗（Onderstepoort）同源性为89．1％-90．9％；基因遗传进化显示，该8株毒株属于国内当前流行的Asia-1型，来源于沈阳的SY-35株与在北京发现的CDV强毒株BJ—09在同一进化分枝，其余来源于沈阳、锦州和辽阳的7株与东北地区流行的CDV在同一进化分枝；氨基酸序列比对结果显示，H蛋白在氨基酸235-245，415-425，595-605等处存在高变异，H蛋白3555位置氨基酸的非同义置换概率相对比较高；糖基化位点以及抗原表位预测分析显示该8株CDV的H基因糖基化位点和抗原表位方面均与Asia-1型CDV野毒株相似，但与疫苗株相比变异较大，特别是我们发现JZ-6株丢失了1个潜在N-糖基化位点。结果表明：辽宁地区宠物犬CD流行以Asia-1型CDV为主，不同病毒株间存在遗传多样性。
- 赵梓淇宫语晨闫飞虎黄培刘静刘静王琪张醒海赵永坤赵永坤高玉伟冯娜
- 关键词：犬瘟热病毒H基因克隆遗传进化
- 新孢子虫抗原及疫苗研究进展被引量：5
- 2015年
- 新孢子虫病是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于牛、羊和犬等多种动物细胞内引起的一种原虫病。新孢子虫寄生于宿主体内可导致孕畜流产或产死胎,以及新生幼畜运动神经障碍和神经系统疾病,给畜牧业造成了很大的经济损失。近年来对新孢子虫抗原蛋白在虫体免疫中的作用研究成为新孢子虫病免疫学研究的热点,新孢子虫抗原蛋白将在新孢子虫疫苗研制中发挥作用。目前还没有预防新孢子虫疫苗投入市场的报道。论文对新孢子虫的抗原蛋白及其疫苗的研究进展进行概述,为疫苗的研制及相应产品的研发提供参考。
- 王雪孟庆峰刘新欣王琪姚贵哲王伟利
- 关键词：新孢子虫抗原疫苗
- 委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2017年
- 原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。
- 焦翠翠金宏丽蒋天琪曹增国曹增国吴芳芳李岭邱泊宁吴芳芳黄培王琪赵永坤冯娜迟航高玉伟黄培杨松涛夏咸柱
- 关键词：委内瑞拉马脑炎病毒原核表达纯化多克隆抗体
- 苏丹型埃博拉病毒糖蛋白原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：1
- 2018年
- 目的原核表达苏丹型埃博拉病毒(Sudan virus,SUDV)糖蛋白(GP),并作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法。方法 PCR扩增SUDV GP基因片段,克隆至pET30a(+)表达载体,IPTG诱导表达SUDV GP,经HisNi柱纯化,SDS-PADE和Western blot鉴定正确的SUDV GP作为包被抗原建立SUDV抗体间接ELISA方法,并对实验条件进行优化。结果SUDV GP在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,建立的抗体间接ELISA检测方法最佳SUDV GP包被量为2μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶320,最佳作用时间1.5h,HRP标记羊抗鼠IgG最佳稀释度1∶10 000,TMB最佳显色时间为7min。该方法的特异性强,样品检测结果与已知血清的符合率为100%,检测SUDV阳性血清的敏感度为1∶40 960,SUDV GP批间及批内的实验结果变异系数(CV)均小于10%。结论成功表达SUDV GP并建立SUDV抗体间接ELISA检测方法,为疫苗免疫效果的评价、疫病的监测及SUDV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础。
- 吴芳芳曹增国焦翠翠王琪迟航侯朋飞黄培金宏丽赵永坤李忠义王化磊杨松涛夏咸柱
- 关键词：原核表达糖蛋白
- 小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：4
- 2016年
- 为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。
- 闫飞虎冯娜王琪李岭赵永坤王铁成黄耕高玉伟王化磊杨松涛夏咸柱无
- 关键词：小反刍兽疫病毒原核表达M蛋白WESTERNBLOT多克隆抗体
