张亚楠
- 作品数：18 被引量：10H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市科技新星计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响
- 2014年
- 目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。
- 陈志达丁丽华张亚楠刘婕朱杰叶棋浓卫勃
- 关键词：小干扰RNA慢病毒载体
- E6AP蛋白结构域突变真核表达载体的构建及其生物学功能检测
- 2016年
- 目的构建E6AP蛋白结构域突变真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法以本实验室保存带有myc标签的E6AP质粒为模板,采用PCR技术扩增出E6AP（1～494）结构域和E6AP（495～852）结构域（即E6AP的HECT结构域）编码区（CDS）序列,将其插入到p XJ-40-myc载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹鉴定其表达及功能;转染人乳腺癌细胞ZR75-1和人胃癌细胞BGC-823,通过CCK-8法测定细胞生长曲线。结果从E6AP蛋白全长CDS中扩增得到约1479、1071 bp的DNA结构域片段,并成功克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,目的蛋白在细胞内成功表达,并且E6AP（495～852）结构域可明显抑制P53蛋白水平,而E6AP（1～494）结构域无抑制作用;细胞生长曲线结果显示,转染E6AP（495～852）结构域突变质粒的乳腺癌、胃癌细胞较空载体细胞生长差异具有统计学意义,而E6AP（1～494）对细胞生长无明显变化。结论成功构建了myc-E6AP（1～494）、（495～852）结构域突变真核表达载体,为进一步研究E6AP蛋白在相关肿瘤发生、发展中的作用奠定一定的基础。
- 熊加秀丁丽华营孙阳陈志达张亚楠贾小萌陈滢洁刘文忠叶棋浓卫勃
- 关键词：P53泛素化肿瘤
- 慢病毒介导的敲低E6AP表达抑制胃癌细胞增殖和迁移被引量：1
- 2016年
- 目的构建稳定敲低E6AP表达的胃癌细胞BGC-823,并检测对胃癌细胞增殖和迁移等恶性生物学行为的影响。方法采用Western印迹方法检测E6AP在不同胃癌细胞系及胃正常黏膜上皮细胞系中的表达情况;将含有E6AP的慢病毒短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的干扰载体与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚肾293T细胞后,收集病毒上清感染胃癌细胞BGC-823,经嘌罗霉素(puromycin)筛选后,获得慢病毒介导的E6AP shRNA的稳定表达细胞,用实时(real-time)PCR和Western印迹方法检测E6AP干扰效果;并利用细胞生长曲线实验、划痕愈合(wound healing)和Transwell实验检测E6AP shRNA对胃癌细胞增殖和迁移的影响。结果 E6AP在不同胃癌细胞系及胃正常黏膜上皮细胞系中均有表达;建立了稳定敲低E6AP的胃癌细胞BGC-823;E6AP shRNA可有效抑制胃癌细胞增殖和迁移。结论 E6AP的生物学功能在胃癌恶性转化过程中发挥重要作用。
- 熊加秀陈志达张亚楠贾小萌陈滢洁熊柚花丁丽华叶棋浓刘文忠卫勃
- 关键词：慢病毒属RNA干扰胃肿瘤细胞增殖
- 磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体的构建及其生物学功能研究
- 2016年
- 目的:构建磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体,并瞬时转染胃癌耐药细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法:以带有pc DNA3.0-Flag标签的Akt1质粒为模板,采用重组PCR技术扩增得到Akt1(T308A)(苏氨酸突变成丙氨酸)、Akt1(T308E)(苏氨酸突变成谷氨酸)位点突变编码区序列,将其插入pc DNA3.0-Flag载体,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP,通过Western印迹和实时定量PCR检测Notch1蛋白和m RNA水平的变化,通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明Akt1(T308A)、Akt1(T308E)的真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP后,利用实时定量PCR和Western印迹证明去磷酸化Akt1(T308A)可抑制Notch1的转录和蛋白水平,模拟持续磷酸化Akt1(T308E)升高Notch1的转录和蛋白表达;细胞生长曲线结果显示,转染Akt1(T308A)较空载体耐药细胞生长慢,而Akt1(T308E)促进耐药细胞生长。结论:PI3K/Akt与Notch1信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用。
- 熊加秀丁丽华刘文忠张亚楠陈志达罗晓丽贾小萌陈滢洁叶棋浓卫勃
- 关键词：AKT1NOTCH1点突变
- Twist1稳定表达细胞株的建立及对乳腺癌细胞上皮-间充质转变的影响被引量：2
- 2016年
- 目的:构建Twist1的慢病毒真核表达载体,并建立稳定表达Twist1的乳腺癌细胞株,研究Twist1在乳腺癌中对上皮-间充质转变(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Twist1编码序列,克隆到慢病毒p CDH载体,构建成p CDH-Twist1,转染293T细胞,Western印迹鉴定p CDH载体介导的Twist1的表达;包装病毒载体,感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响。结果:经Bam HⅠ、Eco RⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Twist1表达载体,Western印迹实验发现Twist1在293T细胞内表达;嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的ZR75-1细胞株。结论:构建了p CDH-Twist1的真核表达载体并建立了稳定表达Twist1的ZR75-1细胞,为进一步研究Twist1在EMT过程中的机制奠定了基础。
- 宋玉华陈滢洁张亚楠刘婕罗晓丽贾晓蒙李欣姜潇丁丽华叶棋浓
- 关键词：TWIST1E-钙黏蛋白乳腺癌细胞
- 微管结合蛋白Tau磷酸化位点突变体的构建及鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的:构建带有Myc标签的Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的Tau蛋白真核表达质粒,并在真核细胞中表达Myc-Tau3m蛋白。方法:利用重组PCR方法得到Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的编码序列,将其插入经Bam HⅠ和KpnⅠ酶切的p XJ40-Myc表达载体,在人293T细胞中转入空载体和重组质粒,利用Western印迹检测其表达及功能。结果:测序和酶切结果证实Myc-Tau3m真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达,表达产物可促进微管的乙酰化。结论:构建了Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变的Myc-Tau3m真核表达载体,为进一步研究Tau蛋白磷酸化的生理机能奠定了基础。
- 贾晓蒙张亚楠罗晓丽陈滢洁丁丽华叶棋浓吕朝晖
- 关键词：突变体磷酸化真核表达
- Snail真核表达载体的构建及功能鉴定
- 2016年
- 目的:构建Snail的慢病毒真核表达载体,并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Snail的全长编码序列,将其克隆到p CDH表达载体上,构建成p CDH-Snail真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达;与包装质粒共转染293T细胞,包装病毒后感染ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响,同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果:Bam HⅠ、XbaⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Snail表达载体,Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功;经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株;在倒置荧光显微镜下观察,ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论:构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体,建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞,为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。
- 陈滢洁姜潇李欣张亚楠刘婕罗晓丽贾晓蒙丁丽华叶棋浓宋玉华
- 关键词：SNAIL上皮钙粘蛋白上皮-间质转化真核表达载体
- 核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位被引量：1
- 2015年
- 目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。
- 罗晓丽周蕾丁丽华张亚楠刘婕贾晓蒙陈滢洁熊加秀陈志达叶棋浓赵丽纯
- 关键词：克隆细胞定位
- GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定
- 2015年
- 目的:构建人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B,并鉴定其表达。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增LC3B全长基因,将其克隆至p EGFP-C1表达载体,得到p EGFP-C1-LC3B重组质粒,酶切和测序鉴定后,转染ZR75-1细胞,Western印迹检测真核细胞中GFP-LC3B融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察自噬诱导剂雷帕霉素处理和未处理ZR75-1细胞质中GFP-LC3B的分布。结果:Western印迹可见GFP-LC3B融合蛋白表达条带;在荧光显微镜下,ZR75-1细胞内可见绿色荧光,雷帕霉素刺激后有明显绿色荧光聚集体形成。结论:人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B构建成功,为进一步研究自噬在乳腺癌细胞中的作用机制奠定了基础。
- 朱杰丁丽华刘婕禾荣华张亚楠陈志达罗晓丽叶棋浓吕朝晖
- 关键词：自噬真核表达载体绿色荧光蛋白
- DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定被引量：2
- 2015年
- 目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经Bam HⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA(siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应(real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA(mRNA)和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明,DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。
- 朱杰刘婕丁丽华禾荣华张亚楠陈志达罗晓丽叶棋浓吕朝晖
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体
