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基于肌红蛋白构筑新型生物催化剂被引量：1: 2017年; 利用计算机模拟与基因工程相结合的方法,对抹香鲸肌红蛋白活性中心疏水空穴进行设计,重点研究了肌红蛋白活性部位68、107位置的氨基酸(大小、疏水性)对肌红蛋白催化性能的影响。设计、制备、表达并纯化了H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G三种变体,测试了不同变体对吲哚羟基化反应的催化性能,并通过计算机模拟阐明肌红蛋白活性部位构筑与其催化性能之间的联系。研究表明:H64D/I107V、H64D/I107A和H64D/I107G三种变体均能催化吲哚的羟基化反应,kcat分别为10.6、9.2和25.2min^(-1);证明了107位置氨基酸的空间位阻效应和68位置氨基酸的疏水性能够显著影响底物在蛋白活性部位的空间构象,进而影响肌红蛋白的催化性能。研究结果为基于肌红蛋白新型生物催化剂的开发提供了新的实验依据与理论基础。; 张芳芳徐甲坤王芳郭辉梁兴国; 关键词：生物催化剂肌红蛋白基因突变计算机模拟

新型猪胃蛋白酶原突变体真核表达体系构建: 2017年; [目的]构建4种新型猪胃蛋白酶原突变体真核表达体系。[方法]以含有猪胃蛋白酶原基因的环状质粒pPICZαA-PGA为模板,对猪胃蛋白酶活性关键氨基酸Asp32和Asp215相关的S35、G76、T216和T218 4个位点定点突变;突变质粒鉴定后电转化至毕赤酵母X-33;qPCR鉴定高mRNA表达转化子;以甲醇诱导表达4 d后SDS-PAGE及酶活测定检测目的蛋白。[结果]成功构建4种新型猪胃蛋白酶原突变体mPG-S35A、mPG-G76A、mPG-T216A和mPG-T 218A;阳性克隆率超过90%;SDS-PAGE检测到清晰的目的蛋白条带,分子量约为48 k Da,4种突变体的酶活分别是11.3 U/mL、22.6 U/mL、16.9 U/mL、13.7 U/mL。[结论]SDS-PAGE检测到4种分子量48 k Da的突变猪胃蛋白酶原清晰条带,四者酶活在11.3~22.6 U/mL之间,成功构建4种新型猪胃蛋白酶原突变体在毕赤酵母以外分泌表达的体系。; 郭辉刘宇郑屿佳武燕月董平梁兴国; 关键词：定点突变

突变G76A和T216A猪胃蛋白酶原的表达及其对核酸消化的影响: 基于前期研究发现猪胃蛋白酶具有消化核酸的作用,为了进一步研究胃蛋白酶调控核酸消化活性的活性位点并分析胃蛋白酶调节核酸消化的机理,我们首先将含有突变目的片段的质粒载体转入巴斯德毕赤酵母X-33细胞中,之后培养转化成功的酵母...; 郭辉刘宇郑屿佳武燕月董平梁兴国; 关键词：胃蛋白酶核酸活性位点定点突变

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郭辉