王洪伟
- 作品数：10 被引量：8H指数：2
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- BCSC-1基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定
- 2014年
- 目的构建BCSC-1基因慢病毒RNA干扰载体并感染人乳腺癌细胞MCF-7,实时荧光定量PCR(QPCR)检测干扰效果。方法 设计并合成两条针对人BCSC-1基因的干扰序列(BCSC-1 shRNA1和BCSC-1shRNA2)以及对照序列(NS),将其连接入载体PLKO.1-sp6-pgk-GFP中,得到两个干扰载体和一个阴性对照载体。通过菌落PCR、双酶切和DNA序列测定等方法对其进行鉴定。将干扰载体与辅助包装质粒Lipofectamine2000共转染HEK293T细胞包装慢病毒并收取病毒上清。所获慢病毒颗粒感染人乳腺癌细胞MCF-7,QPCR方法检测两种干扰载体对BCSC-1基因的抑制效率。结果 菌落PCR结果显示目的片段插入PLKO.1-sp6-pgk-GFP载体,DNA测序证实插入序列无误。QPCR结果显示两种干扰载体感染人乳腺癌细胞MCF-7后,BCSC-1 shRNA1组和BCSC-1 shRNA2组BCSC-1基因表达水平分别为0.34±0.046和0.63±0.043,较空白对照组和NS组均有明显下降(P<0.05),且BCSC-1 shRNA1抑制效果优于BCSC-1 shRNA2(P<0.05)。结论 成功构建了两种BCSC-1基因慢病毒干扰载体,两载体均能下调人乳腺癌细胞MCF-7中BCSC-1基因表达水平。
- 王洪伟刘义帅邸大琳魏兵吴国庆鞠吉雨
- 关键词：慢病毒载体基因MCF-7细胞实时荧光定量PCR
- 小鼠IL-35基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的构建小鼠IL-35基因靶向shRNA干扰的慢病毒表达载体，抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6中IL-35的表达。方法设计合成IL-35EBl3亚基基因靶向shRNA序列，构建shRNA载体PLKO．1-IL-35EB13shRNA．GFP，测序正确后，三质粒病毒包装系统（质粒载体＋psPAX2＋pMD2．G）包装成表达干扰IL-35EB13shR-NA的慢病毒，慢病毒感染靶细胞Hepat-6，镟光显微镜下观察感染效率，以实时定量RT—PCR分析对Hepal-6细胞IL-35EBl3基因表达的干扰效果。结果测序证实，成功构建了真核表达干扰载体PLKO．1-IL-35EB13shRNA．GFP；并成功包装出表达干扰IL-35EBl3shRNA的慢病毒，以MOI值4．6pfu／细胞感染Hepal-6细胞，镜下显示感染效率约90％；RT-PCR结果表明所构建的3个慢病毒载体PLKO．1-IL-35EBl3shRNA—GFP均可以有效干扰IL-35EBl3的表达，其中E545干扰效率最高，为64％．结论成功构建IL-35EBl3亚基基因的shRNA慢病毒表达载体，该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。
- 刘义帅王洪伟邸大琳付晓燕吴国庆王丽娜鞠吉雨
- 关键词：IL-35SHRNA慢病毒
- BCSC-1过表达抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移
- 2013年
- 目的:研究人乳腺癌候选抑癌蛋白1基因(breast cancer suppressor candidate 1,BCSC-1)过表达对肝癌Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移的影响,并探讨其可能的机制。方法:将pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和空质粒pcDNA3.1/v5-HisB转染的Bel-7402细胞作为BCSC-1组和空载体组,Bel-7402细胞为野生型组。MTT法、Transwell实验、体外黏附实验和划痕实验分别检测BCSC-1过表达对Bel-7402细胞增殖、侵袭、黏附和迁移的影响,Real-time PCR检测BCSC-1过表达对Bel-7402细胞中与细胞增殖、黏附相关的ICAM-1、PTTG、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA表达的影响。结果:转染pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1后Bel-7402细胞中BCSC-1 mRNA的表达水平显著高于空载体组和野生组细胞[(10.58±0.56)vs(1.10±0.22)、(1.00±0.01),均P<0.01],成功制备BCSC-1稳定过表达的Bel-7402细胞株。与空载体组和野生型组相比,BCSC-1组Bel-7402细胞生长速度明显减慢[72 h:(0.29±0.003)vs(0.34±0.014)、(0.35±0.013),均P<0.05];侵袭率[(76.20±1.85)%vs(93.42±3.24)%、(100.00±1.05)%,均P<0.01)]、黏附率[(58.57±0.84)%vs(97.14±0.84)%、(100.00±1.30)%,均P<0.01]显著降低,迁移距离显著降低[(116.60±10.58)vs(231.33±10.26)、(237.96±11.58)μm,均P<0.01];同时过表达BCSC-1的Bel-7402细胞的OPN mRNA表达量明显降低[(0.12±0.06)vs(0.95±0.14)、(1.00±0.08),均P<0.01],ICAM-1、PTTG mRNA表达无明显变化。结论:BCSC-1过表达能够抑制Bel-7402细胞的增殖、侵袭、黏附和迁移能力,其机制可能与OPN基因表达下降有关。
- 田俊芳邸大琳王洪伟巩方郇雪洁鞠吉雨
- 关键词：肝癌BEL-7402细胞迁移
- 慢病毒介导IL-35基因沉默对Hepa1-6细胞恶性生物学行为的影响
- 背景:IL-35为新发现的一种细胞因子,在多种免疫细胞及肿瘤细胞均有表达.目的:建立慢病毒介导IL-35基因稳定沉默小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,研究沉默IL-35基因对Hepa1-6细胞恶性生物学行为的影响.方法:构建...
- 刘义帅邸大琳王洪伟王丽娜林志娟鞠吉雨
- 关键词：IL-35SHRNA慢病毒
- 慢病毒介导IL-35基因沉默对Hepa1-6细胞恶性生物学行为的影响
- 背景:IL-35为新发现的一种细胞因子,在多种免疫细胞及肿瘤细胞均有表达。目的:建立慢病毒介导IL-35基因稳定沉默小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,研究沉默IL-35基因对Hepa1-6细胞恶性生物学行为的影响。方法:构建...
- 刘义帅邸大琳王洪伟王丽娜林志娟鞠吉雨
- 关键词：IL-35SHRNA慢病毒
- 文献传递
- BCSC-1基因异位表达对MDA-MB-231侵袭能力影响及其机制探讨被引量：2
- 2014年
- 目的:利用已构建的乳腺癌候选抑制蛋白-1(breast cancer suppressor candidate 1,BCSC-1)基因真核表达质粒转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,观察BCSC-1基因异位表达对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力的影响,初步探讨其影响机制。方法:利用脂质体将pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和空质粒pcDNA3.1/v5-HisB转染野生型MDA-MB-231细胞,以转染空质粒pcDNA3.1/v5-HisB的MDA-MB-231细胞为对照组,野生型MDA-MB-231细胞为空白对照组,转染后经G418加压筛选获得稳定BCSC-1表达细胞株。细胞划痕和Transwell细胞侵袭实验分析转染前后细胞侵袭能力的改变,实时荧光定量PCR分析转染前后基因的变化,细胞免疫组化分析转染前后BCSC-1以及细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的变化。结果:转染后成功获得BCSC-1基因异位高表达稳定细胞株。细胞划痕实验显示,转基因组细胞平均迁移距离为(105.33±13.61)μm,较对照组(225±18.02)μm和对照组(236±16.46)μm明显降低,F=60.50,P=0.002。细胞侵袭实验显示,转基因组24h平均穿膜细胞数为34.67±2.52,较空白对照组56.66±2.08和对照组63.33±4.16明显降低,F=72.33,P=0.005。实时定量荧光PCR结果显示,转基因组BCSC-1表达水平为32.66±2.51,较对照组2.33±1.52和空白对照组明显升高,F=333.12,P=0.001;转基因组ICAM-1表达水平为28.67±3.79,较对照组3.33±1.53和空白对照组明显升高,F=127.14,P=0.003。细胞免疫组化结果显示,转染后BCSC-1以及ICAM-1表达水平明显增高。结论:BCSC-1基因的异位表达对MDA-MB-231细胞体外转移和侵袭能力有明显的抑制作用,这种抑制作用可能与ICAM-1表达增高有关。
- 邸大琳陈蕾王丽娜王洪伟魏兵王会东鞠吉雨
- 关键词：乳腺肿瘤基因表达MDA-MB-231细胞
- TGF-β1和HSP70在大鼠肝癌早期诊断中的价值探讨被引量：2
- 2013年
- 目的:通过动态检测大鼠肝癌模型造模各阶段血清中TGF-β1和HSP70水平并与传统指标AFP比较,对其在肝癌早期诊断中的价值做综合的评价。方法:用CCL4诱导大鼠肝硬化基础上的肝癌模型。从造模第6周起,每两周心脏采血一次,ELISA法检测大鼠血清中TGF-β1、HSP70和AFP水平,并取部分肝组织行病理学检查。结果:造模第8周发生肝硬化,第10周发生不典型增生及早期肝癌结节。造模第10周TGF-β1和HSP70水平即显著升高,TGF-β1在肝硬化阶段无显著升高,而HSP70则略微有升高,二者特异性分别为90%和60%,阳性率分别为55%和70%,联合检测的阳性率为80%,造模第12周的阳性率分别达85%和90%,联合检测阳性率达100%;AFP水平在造模第12周才有显著升高,肝硬化阶段也有升高并与早期肝癌无显著性差异。其阳性率和特异性分别为60%和30%。结论:传统指标AFP对极早期的肝癌不敏感,特异性不高,而TGF-β1和HSP70均较AFP敏感、特异,二者联合可提高检测敏感性。
- 王妮刘义帅王洪伟魏兵王丽娜
- 关键词：大鼠肝癌模型TGF-Β1HSP70AFP
- BALB/c小鼠原位移植肝癌模型的建立及鉴定被引量：3
- 2015年
- 目的：利用小鼠肝癌细胞株H22细胞肝脏原位种植法建立BALB／c小鼠原位移植肝癌模型，为研究肝脏肿瘤奠定基础。方法取新鲜小鼠腹腔传代的H22细胞，生理盐水洗涤2次，调细胞浓度为1×10^7／ml，与Matrigel按4∶1比例混合，用10μl微量进样针在开腹直视下沿肝叶长轴种植于BALB／c小鼠的肝左叶，每只5μl，逐层关腹，常规饲养2周后，处死小鼠观察肿瘤形成情况，检测小鼠肝脏原位癌的形成率及小鼠存活率，形态学和病理学方法鉴定造模效果。结果肉眼可见小鼠肝脏出现单个灰白肿瘤结节，病理学方法证实为肝癌，小鼠存活率和成瘤率均为95％，肿瘤大小均匀。结论成功建立了一种稳定、简单可行的BALB／c小鼠原位移植肝癌模型。
- 王丽娜刘义帅王洪伟肖伟玲鞠吉雨
- 关键词：H22细胞小鼠
- RNA干扰抑制BCSC-1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖、迁移和侵袭的影响
- 背景:BCSC-1为新发现的抑癌基因,在多种肿瘤均表现为表达下调.目的:慢病毒RNA干扰载体感染人肝癌细胞HepG2,探讨干扰后HepG2细胞迁移、侵袭和增殖能力等生物学行为的变化.方法:所获慢病毒颗粒感染人肝癌细胞He...
- 王洪伟邸大琳刘义帅刘艳菲付晓燕鞠吉雨
- 关键词：肝癌细胞SHRNA
- RNA干扰抑制BCSC-1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖、迁移和侵袭的影响
- 背景:BCSC-1为新发现的抑癌基因,在多种肿瘤均表现为表达下调。目的:慢病毒RNA干扰载体感染人肝癌细胞HepG2,探讨干扰后HepG2细胞迁移、侵袭和增殖能力等生物学行为的变化。方法:所获慢病毒颗粒感染人肝癌细胞He...
- 王洪伟邸大琳刘义帅刘艳菲付晓燕鞠吉雨
- 关键词：肝癌细胞SHRNA
- 文献传递
