华玲
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院放射与辐射医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 分泌型毕赤酵母人全长抗体库的构建与鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的基于N-糖基化部分改造毕赤酵母构建表达分泌型人全长抗体库。方法基于酵母分泌型表达载体pPICZαA构建双启动子串联表达重链和轻链恒定区基因的载体pPICZαA-C H-C L,经基因序列分析和Western blot分析验证。设计44对简并引物经逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增获得轻链可变区V L和重链可变区V H基因库。通过PCR将其插入上述恒定区表达载体构建全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L。将该库电转化N-糖基化部分改造后宿主菌株GS115Y。随机挑取20个平板克隆进行菌液PCR鉴定、基因分析,并提交IgBLAST-imgt数据库鉴定抗体库正确性与多样性。结果获得表达重链和轻链恒定区的表达载体pPICZαA-C H-C L,并在此基础上初步获得全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L,库容量为105。结论成功构建了分泌型N-糖基化毕赤酵母人全长抗体库。
- 刘强张晶张小爱杨小盼华玲高新付洁宋海峰
- 关键词：毕赤酵母抗体库分泌表达
- 毕赤酵母电转化方法的探索被引量：2
- 2013年
- 旨在通过优化转化条件提高毕赤酵母电转化效率。采用不同的酵母细胞预处理液成分及浓度、不同的细胞体积、不同的质粒DNA用量,在不同的电压下进行转化,计数转化后在平板上产生的克隆数,通过计算每微克DNA获得的克隆数来评价转化效率。研究表明,用0.1 mol/L LiAc,0.01 mol/L DTT,0.6 mol/L sorbitol,0.01 mol/L Tris-HCl处理细胞可获得最佳转化效率;质粒DNA用量为10 ng时转化效率最高。使用0.1 cm电转杯,采用0.6 kV电压,对80μL细胞进行转化,转化效率最高,可达9.6×105/μg DNA;而使用0.2 cm电转杯,采用1.1 kV电压,对150μL细胞进行转化,转化效率最高,可达8.8×105/μg DNA。采用优化后条件,用10μg pPIC9K质粒DNA转化GS115,可获得1.1×106个转化子。此外通过对3种常用毕赤酵母载体转化效率的比较,发现pPIC9K的转化效率约是pPICZαA的160倍,是pGAPZαA的2 900倍。采用优化后的转化条件,毕赤酵母的电转化效率从103-4提升到了106。采用单个电转杯最多可获得1.1×106个转化子。
- 杨小盼董立厚万德有华玲刘蕴慧高新
- 关键词：毕赤酵母电转化
- 血管内皮生长因子全长抗体在毕赤酵母中的表达与活性鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL,评价其在毕赤酵母中的表达产物与抗原的结合特性,及其抑制细胞增殖的活性。方法:利用基因合成分别获得VEGF抗体CL和CH序列,分别构建pPICZαA-CH和pPICZαA-CL重组质粒,再利用同尾酶特性构建双启动子表达盒的重组pPICZαA-CH-CL载体,用Westen印迹对其进行表达鉴定后将VH和VL序列插入该载体,获得VEGF的全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL;通过膜筛和ELISA进行菌株筛选,并对VEGF抗体表达阳性菌株进行小量表达和纯化,采用CCK-8法对其抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性进行初步评价。结果:获得表达轻、重链的VEGF抗体表达载体,ELISA实验证明pPICZαA-VH-CH-VL-CL具有一定的VEGF抗原结合特性;体外增殖实验表明,该抗体可以以剂量依赖性抑制HUVEC增殖。结论:在毕赤酵母中表达、纯化了具有一定功能活性的VEGF全长抗体,为后续比较研究酵母糖基化改造对VEGF抗体的药效学和药代学的影响提供了基础。
- 陈薇张晶刘强华玲刘蕴慧莫嫣娉高新付洁宋海峰
- 关键词：血管内皮生长因子毕赤酵母抗体肿瘤增殖
- 不同肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白N-糖基化修饰糖链的初步分析被引量：4
- 2013年
- 目的建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异。方法用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂,所得糖链采用ZIC-HILIC亲水作用色谱柱结合离子阱质谱进行分析。以市售TNFR-Fc融合蛋白为标准品,优化影响标记效率的各种因素后,对A和B两种TNFR-Fc融合蛋白制品的N-糖基化修饰糖链进行了分析和比较。结果 TNFR-Fc融合蛋白A和B中的修饰糖链主要含有岩藻糖、末端唾液酸、末端半乳糖、末端N-乙酰葡糖胺等糖型,且末端唾液酸含量相近,但融合蛋白A的岩藻糖和末端N-乙酰基葡萄糖的含量显著高于融合蛋白B,而融合蛋白B末端半乳糖含量高于融合蛋白A。结论成功建立了基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例,对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值,并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以及药代动力学研究奠定了良好基础。
- 何椿鹏华玲杨小盼万德有李萌萌王清清陈方董立厚高新高月宋海峰
- 关键词：N-糖基化LC-MS
