李健友
- 作品数：5 被引量：35H指数：3
- 供职机构：东北农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达被引量：7
- 2016年
- 研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I（EC.3.4.23.18）。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因序列pep1（GI：473517）设计引物,以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明,扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99%,其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶（GAA90749.1）相似性为100%,将该基因命名为pep B。构建黑曲霉表达载体p SZHG-pep B,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,筛选得到在gla A位点发生同源重组纯合转化子。经摇瓶发酵后,对产物进行SDS-PAGE、酶活检测以及酸性蛋白酶酶学性质和酶稳定性研究。结果表明,纯合同源重组菌株经SDS-PAGE检测时在47 ku左右处有明显目的蛋白条带,其发酵产物酸性蛋白酶酶活达5 543 U·m L-1,为出发菌株152倍。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为50℃,最适反应p H 3.0,在4℃和25℃条件下,酶在p H 3.0~4.0时较稳定。
- 李杰吴婷马南王欣杨建乐李健友张会
- 关键词：酸性蛋白酶黑曲霉同源重组分泌表达
- 吉林省牛病毒性腹泻病毒流行病学调查分析被引量：11
- 2019年
- 为了解吉林省牛病毒性腹泻的流行情况,试验采用纳米PCR检测技术和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体ELISA检测试剂盒对吉林省部分省界地区BVDV进行病原和血清抗体流行病学调查。对BVDV 5′-UTR扩增,对扩增出的部分序列进行测序,构建系统遗传进化树。结果表明:在635份血清样品中,ELISA检测抗体阳性397份,阳性率为62.52%。对血清样品及临床组织病料采用纳米PCR方法进行检测,共检测出150份阳性样品(其中血清122份、临床组织病料28份),BVDV阳性率为19.21%。在辽宁省省界地区(四平市、梨树县、东丰县、梅河口市)的BVDV血清抗体阳性率较高,吉林市、丰满区较低。吉林省北部的宁江区、扶余市、榆树市及南部地区的东丰县、柳河县的BVDV抗原阳性率高于东部延边州地区(敦化市、延吉市)及西部地区(白城市),中部地区(吉林市、丰满区)的BVDV抗原阳性率较高。对10份阳性样品的PCR产物进行测序分析,结果牛群中流行毒株均为BVDV 1型,与BVDV JL-1株同源性最高,为吉林省主要流行强毒株。说明吉林省检测地区都存在不同程度的BVDV感染情况。
- 刘泽余李健友刘占悝王楠张淑琴王超郭利张加力
- 关键词：牛病毒性腹泻流行病学调查血清学ELISA测序分析
- 细胞病变型牛病毒性腹泻病毒对宿主细胞自噬作用的研究被引量：3
- 2017年
- 细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物细胞内损伤的细胞器和长寿命蛋白通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用的高度保守的分解代谢过程。本研究旨在了解细胞病变型(CEP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV NM)对宿主细胞MDBK细胞自噬作用的影响。实验使用BVDV NM株感染宿主细胞MDBK,在不同时间点分别通过透射电镜观察自噬体形成、报告荧光GFP-LC3自噬底物检测以及Western blot方法鉴定细胞自噬标记物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ和P62的表达等试验方法对自噬进行检测。结果显示,感染BVDV NM株的MDBK细胞出现了明显的细胞病变;透射电镜能观察到细胞中存在大量的双层膜结构的自噬泡;转染GFP-LC3荧光质粒后,在感染病毒的细胞内出现增多的聚集绿色荧光自噬小体;此外,随着BVDV NM株感染MDBK时间的延长可以发现LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的量逐渐增加以及P62蛋白的降解。试验表明BVDV NM株感染MDBK可以促进细胞自噬的发生。
- 李家伟李健友王超张淑琴程世鹏郭利
- 关键词：细胞自噬
- 牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用被引量：2
- 2017年
- 试验旨在建立牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza type-3 virus,BPIV3)纳米PCR(Nano-PCR)与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)新型快速分子检测技术,对其进行特异性和敏感性对比试验,并对10份临床样品进行了检测。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR和LAMP方法只对BPIV3特异,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒无交叉反应;建立的Nano-PCR和LAMP方法具有相同的敏感性,均是普通PCR的10倍,最低核酸检出量均为4.16×102拷贝/μL。临床检测结果显示,建立的两种方法阳性符合率为100%,且阳性检出率均高于普通PCR。因此,本试验建立的Nano-PCR和LAMP方法为BPIV3的临床诊断提供了更快速、敏感、可靠的工具。
- 李健友李家伟王超王超郭利
- 关键词：LAMP
- 牛病毒性腹泻病毒Nano-PCR检测方法的建立及初步应用被引量：13
- 2018年
- 为建立一种特异、灵敏、快速检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的分子检测方法,本研究利用金纳米颗粒材料与传统PCR技术相结合,针对BVDV 5′UTR保守序列设计引物,建立了BVDV Nano-PCR新型分子检测方法,并与RT-PCR及商品化IDEXX试剂盒BVDV抗原检测方法分别对临床样品进行对比研究。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR只对BVDV特异,而对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛副流感3型病毒（BPIV3）均无交叉反应;Nano-PCR敏感性是普通PCR的10倍,最低核酸检测量为6.84×10~2copies/L。临床检测结果显示,建立的Nano-PCR方法对38份临床样品的阳性检出率为34.21%,是RT-PCR的2.6倍,是IDEXX试剂盒的1.5倍。本研究结果表明,建立的BVDV Nano-PCR方法可以用来对临床样品进行快速诊断和鉴定,具有特异性高、灵敏度好、快速稳定的优点。
- 李健友李健友刘占悝李家伟张淑琴张淑琴王超
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒RT-PCR
