赖月华
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 供职机构：广西医科大学附属肿瘤医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广西壮族自治区自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人类microRNA-1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的:构建microRNA-1246慢病毒抑制载。方法针对microRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段,应用基因重组技术将目的基因片段克隆到GV280慢病毒载体中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组克隆的成功构建,将GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,用病毒液感染siha细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-mir-1246down在siha细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-mir-1246down稳转细胞株。用细胞计数的方法检测细胞的生长率。结果①对菌落进行PCR鉴定筛选出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确;②GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞产生重组慢病毒;③目的mir-246down被慢病毒成功导入siha细胞中,同时达到稳定表达,转到率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP;④细胞计数结果显示在siha细胞中microRNA-1246的下调细胞的生长速度减弱。结论成功构建microRNA-1246慢病毒抑制载体,建立siha细胞mir-1246-down的稳转株,microRNA-1246在siha细胞中下调的siha细胞的增殖能力下降.这为研究microRNA-1246在宫颈鳞癌siha细胞的作用及其机制提供了可靠的基础。
- 赖月华姚德生杜萍卢艳
- 关键词：慢病毒载体MICRORNA宫颈癌细胞增殖
- 慢病毒介导的miR-1246表达下调对子宫颈癌细胞系SiHa细胞生物学行为的影响被引量：3
- 2018年
- 目的 探讨慢病毒介导的微小RNA（miR）-1246表达下调后，对子宫颈癌细胞系SiHa细胞生物学行为的影响，以及对其下游蛋白表达的调控作用。 方法 针对人miR-1246的靶序列合成含有反向互补序列的寡核苷酸片段并克隆至慢病毒载体，构建重组慢病毒 LV-miR-1246-抑制物（inhibitor）。实验分为3组，即抑制组（感染重组慢病毒LV-miR-1246-inhibitor）、阴性对照组（LV-NC组，感染空载体病毒颗粒）和空白对照组（NC组，无干预措施仅加培养基）。采用逆转录（RT）-PCR技术检测3组SiHa细胞中miR-1246的表达水平，活细胞计数（CCK-8）法、体外侵袭实验、流式细胞仪分别检测3组SiHa细胞的增殖、侵袭、凋亡情况。建立子宫颈癌裸鼠移植瘤模型，观察miR-1246表达下调对移植瘤生长的影响，蛋白印迹（western blot）法检测3组裸鼠移植瘤组织中血小板反应蛋白2（THBS2）及基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP-9蛋白的表达。 结果 （1）miR-1246表达：抑制组SiHa细胞中miR-1246表达水平（0.11±0.13）明显低于LV-NC组、NC组（分别为1.14±0.86、1.30±0.73，P〈0.01）。（2）增殖能力：培养不同时间（分别为24、48、72、96 h）后，抑制组SiHa细胞的A值均明显低于LV-NC组、NC组，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.01）。（3）侵袭能力：抑制组的穿膜细胞数［（71±4）个］明显少于LV-NC组、NC组［分别为（162±5）、（188±5）个，P〈0.01］。（4）细胞凋亡率：抑制组SiHa细胞凋亡率［（16.10±3.37）%］明显高于LV-NC组、NC组［分别为（5.67±0.89）%、（1.78±0.08）%，P〈0.01］。（5）移植瘤体积：抑制组裸鼠移植瘤体积［（287±59）mm 3 ］明显小于LV-NC组、NC组［分别为（571±137）、（657±144）mm 3 ，P〈0.01］。（6）与LV-NC组、NC组比较，抑制组裸鼠移植瘤组织中THBS2蛋白的表达水平明显升高（P〈0.05），而MMP-2、MMP-9�
- 杜萍赖月华姚德生卢艳陈军莹丁楠
- 关键词：细胞系微RNAS
- 人类微小RNA-1246慢病毒抑制载体的构建及对宫颈鳞癌细胞增殖和侵袭的影响
- 2016年
- 目的构建并鉴定微小RNA(miRNA)-1246慢病毒抑制载体,并探讨miRNA-1246下调对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法针对miRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段设计引物并合成目的基因miRNA-1246-down,应用基因重组技术将目的基因克隆到空载质粒GV280中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组慢病毒质粒(GV280-miRNA-1246-down)的构建是否成功,将GV280-miRNA-1246-down、Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,再用重组病毒液感染宫颈鳞癌细胞Si Ha,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-miRNA-1246-down在Si Ha细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-miRNA-1246-down稳转细胞株。将Si Ha细胞分为空白组(NC组)、阴性病毒组(NC-LV组)、miRNA-1246下调组(miRNA-1246-down-LV组),用细胞计数的方法检测细胞的生长率,用Transwell检测细胞侵袭能力。结果 (1)对菌落进行PCR鉴定筛选构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确。(2)慢病毒将目的基因miRNA-1246-down成功导入Si Ha细胞中,同时达到稳定表达,转染率达90%以上,在荧光显微镜下能直接观察到GFP。(3)miRNA-1246-down-LV组Si Ha细胞增殖数低于其他两组(P<0.05),细胞穿膜次数较其他两组减少(P<0.05)。结论 miRNA-1246慢病毒抑制载体构建成功,miRNA-1246稳定下调的Si Ha细胞株建立成功。在Si Ha细胞中miRNA-1246下调可抑制宫颈鳞癌Si Ha细胞的增殖以及侵袭能力。
- 赖月华姚德生杜萍卢艳
- 关键词：宫颈癌慢病毒微小RNA增殖
