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慢病毒感染方法构建稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系被引量：3: 2013年; PDRG1(p53 and DNA-damage regulated 1)是实验室通过文库筛选发现的参与NF-kB信号通路调控的一个新基因。已知PDRG1在多种肿瘤中高表达,并参与p53信号通路;同时该基因受UV以及基因毒性等刺激调控。但其在NF-κB信号通路中作用尚未见报道,为了深入研究PDRG1对NF-κB信号通路的调控机理,构建了稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系。选择了基于慢病毒载体pLKO.1的感染体系,该慢病毒体系可以同时感染分裂期与非分裂期的细胞,将目的基因干涉序列稳定整合至靶细胞基因组中;再经过抗生素压力筛选后在短时间内获得稳定干涉目的基因表达的细胞株。设计合成PDRG1干涉序列并克隆至pLKO.1载体,转染病毒包装细胞293TN后收集慢病毒上清感染HeLa细胞系,进一步经过嘌呤霉素压力筛选成功获得稳定表达PDRG1干涉序列的细胞株。该稳定细胞株的建立为PDRG1的功能研究提供了必要的实验工具。; 巩伟丽徐广韩秋影陈媛; 关键词：慢病毒感染

基于Keima荧光蛋白的线粒体自噬评价体系的建立: 2017年; 目的:探讨建立一种基于Keima荧光蛋白评价线粒体自噬的体系。方法:由于Keima蛋白具有在酸性和中性pH中荧光信号不同的特性,因此定位于线粒体的Keima(mt-Keima)可显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体,以此可以直观反映线粒体自噬的程度。构建定位于线粒体的Keima(mt-Keima)稳定表达载体,利用慢病毒感染的方式获得稳定表达细胞系。以CCCP刺激诱导线粒体自噬,观察刺激0~8 h 440 nm通道(指示中性pH下的Keima)和586 nm通道(指示酸性pH下的Keima)激发荧光信号的变化。结果:电泳结果显示mt-Keima基因片段扩增成功,酶切质粒鉴定结果显示重组质粒构建成功。不同pH条件下440 nm和586 nm激发光激发出的荧光信号不同,表明Keima蛋白表达正常并能够指示酸碱变化。在线粒体自噬诱导剂CCCP刺激下,细胞的酸性荧光信号随刺激时间逐步增加,表明线粒体自噬程度逐渐增强。结论:构建的体系能够准确评价线粒体自噬,为进一步探讨线粒体自噬机制提供了实验基础。; 陈洪丞成姚铖铖陈佳意徐广潘欣; 关键词：荧光蛋白

阿司咪唑对宫颈癌细胞HeLa自噬的影响被引量：2: 2018年; 该研究利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、稳定表达m Cherry-EGFP-LC3B(microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3)自噬双标荧光细胞、mt-Keima荧光探针活细胞扫描技术在人宫颈癌细胞He La中检测了多种自噬相关标志物,探究了阿司咪唑(astemizole,AST)对He La细胞自噬的影响。结果表明,阿司咪唑在He La细胞中引起自噬标志蛋白质LC3-II与SQSTM1/p62的显著累积,并存在剂量和时间依赖性效应;阿司咪唑导致He La细胞存活率显著降低;用自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)阻断自噬流(autophagic flux)后,再加入阿司咪唑不能促进LC3-II进一步累积;阿司咪唑处理细胞后自噬体与自噬溶酶体的数量均显著增加;此外,阿司咪唑显著抑制了线粒体氧化磷酸化解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)导致的线粒体标志蛋白质TOMM20(translocase of outer mitochondrial membrane 20)的降解,其线粒体自噬水平显著低于对照组。以上结果证明了阿司咪唑有抑制自噬流的作用,导致损伤的线粒体不能被顺利降解,并且提示该作用可能是通过抑制溶酶体功能实现的。; 赵菲徐广陈佳意李婷韩秋影张学敏潘欣; 关键词：自噬阿司咪唑线粒体

COPS3的稳定干涉细胞系建立及其在NLRP3炎症小体激活中的作用被引量：2: 2015年; COPS3(COP9 signalosome subunit 3)作为COP9信号复合体的第三个亚基,在多种恶性肿瘤中高表达。本实验室通过酵母双杂交系统筛选,发现COPS3与NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3)存在相互作用。目前关于COPS3与NLRP3炎症小体的相关性未见文献报道。为了研究COPS3对NLRP3炎症小体的影响,利用慢病毒感染系统建立了稳定干涉COPS3的THP1细胞系。首先将COPS3的不同干涉序列片段稳定整合到THP1细胞中,通过嘌呤霉素压力筛选,应用实时定量荧光PCR(real time PCR)手段检测COPS3的干涉效果,最终确定成功建立干涉COPS3的稳定细胞株。在稳定敲低COPS3的细胞株中,发现NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。综上提示,COPS3能够正向调节NLRP3炎症小体的激活。; 郭赛赛常艳涂海情徐广秦璇和吴敏李慧艳李爱玲; 关键词：慢病毒

IFI27L2慢病毒稳定干涉细胞系的建立以及其在炎症小体激活中的功能鉴定: 2015年; 通过构建IFI27L2分子的慢病毒干涉表达载体,建立IFI27L2表达下调的THP1、U937稳定细胞系。将携带特异性干涉IFI27L2的DNA片段克隆插入p LKO.1载体中,并制备携带不同干涉序列的慢病毒颗粒。将获得的慢病毒颗粒感染THP1、U937细胞,建立稳定干涉细胞系,经Real-time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测THP1、U937细胞中内源IFI27L2的干涉效果。构建的重组质粒经酶切鉴定shRNA正确插入慢病毒载体,测序鉴定序列正确;并有干涉效果。成功制备了稳定干涉IFI27L2的慢病毒颗粒,建立IFI27L2稳定下调的THP1、U937两种细胞系;并初步证明稳定干涉IFI27L2能够抑制NLRP3炎症小体的激活。; 张宇程涂海情徐广谭博李慧艳; 关键词：慢病毒

shRNA-resistant Gankyrin质粒的构建及鉴定: 2013年; gankyrin是近年来发现的一种癌基因,研究表明其表达产物Gankyrin与肿瘤发生密切相关。实验室前期工作发现Gankyrin表达水平与临床乳腺癌转移存在正相关,并可能通过多个环节影响乳腺癌的转移。本研究利用PCR介导的定点突变技术,构建了shRNA-resistant Gankyrin抵抗型质粒。经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,抵抗型质粒构建成功;经Western Blot检测,抵抗型质粒在HEK293T细胞中正确表达,为进一步研究Gankyrin在乳腺癌转移中的作用及其分子机制提供了重要的实验材料。; 赵青柏兆方徐广刘朝山巩伟丽周涛; 关键词：定点突变

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徐广