王健
- 作品数：20 被引量：110H指数：6
- 供职机构：武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金“十五”重点攻关项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生化学工程更多>>
- 重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究被引量：4
- 2004年
- 将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA。根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3茨┒紊杓埔欢砸锝蠵CR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变。但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T C,517A G以及630C T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T。以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变。
- 涂海军孟小林徐进平鲁伟王健
- 关键词：人白细胞介素12杆状病毒外源基因突变
- 对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用被引量：16
- 2006年
- 根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp19的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM‐T载体中,经过BamHⅠ/HindⅢ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中。用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origam(iDE3)pLysS,在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-VP19以可溶性的形式得到表达,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合。目的蛋白经Ni2+柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾。实验结果表明注射Trx-VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用。
- 贾启军孟小林徐进平王健鲁伟
- 家蚕抗菌肽CD高效表达及其抗BmNPV感染作用被引量：5
- 2006年
- 通过大肠杆菌JM109诱导家蚕,提取其脂肪体总mRNA后,通过RT-PCR得到cDNA,根据GenBank上家蚕抗菌肽CecropinD的cDNA序列,设计并合成引物,然后PCR扩增得到CecropinD肽基因并克隆到pGEM-T载体中,经过EcoRΙ和XhoI酶切,连接并将CecropinD肽基因插入pET32a表达载体中。用重组质粒pET32a-ecropinD转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-CecropinD以可溶形式得到高效表达,经SDS-PAGE检测显示分子量为23kDa与预期大小相符,表达量约为总蛋白的30%。融合蛋白经Ni2+柱纯化后通过肠激酶切割后释放为Trx(18kDa)和CecropinD(5kDa),最后通过超滤管分离得到重组抗菌肽。通过抑菌实验测得重组CecropinD对于革兰氏阴性及阳性菌均有抑菌活性。并将重组CecropinD与家蚕病毒BmNPV作用混合4h后,一起投喂家蚕,发现病毒感染力有明显降低,说明其有抗病毒感染作用。
- 李伟灿孟小林徐进平王健鲁伟徐智圣
- 关键词：抗菌肽活性表达
- hrpZ基因在大肠杆菌中的高效表达与活性检测被引量：7
- 2005年
- PCR扩增hrpZ基因片段，克隆到pGEM-T载体中，经EmR Ⅰ／Xho Ⅰ酶切、连接将hrpZ基因插入大肠杆菌表达载体pET32b(+)硫氧还蛋白下游，构建重组表达质粒pET-hrpZ，再将其转化至E．coli BL21(DE3)中，经筛选得到阳性克隆子，IPTG诱导表达HrpZ蛋白。SDS-PAGE显示，目的蛋白在重组菌株中得到了可溶性高效表达。该重组蛋白分子量为55．8 kD，与理论值大小相符。采用叶片穿刺法，融合蛋白具有诱导烟草过敏反应的生物功能。
- 丁玲孟小林徐进平王健鲁伟
- 关键词：可溶性蛋白超敏反应
- HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测被引量：3
- 2005年
- 将hrpN基因插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建重组表达载体pPIC6αA-hrpN,经电击转化毕赤酵母菌株X-33和杀稻瘟素筛选,得到高效分泌表达harpinEa的毕赤酵母菌株。经初步纯化、SDS-PAGE分析和生物测定,结果显示,诱导96h的此重组菌大量表达harpinEa,表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinEa。
- 黄世容孟小林徐进平鲁伟王健
- 关键词：毕赤酵母分泌表达融合蛋白活性检测
- 鲤鱼生长激素和对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28的融合表达及功能研究被引量：5
- 2008年
- 鲤鱼生长激素GH是鲤鱼生长腺体分泌并促进鲤鱼生长的一种分泌蛋白。对虾白斑综合病毒(WSSV)VP28蛋白为囊膜蛋白,是病毒感染宿主的必需因子。根据gh和vp28的上下游序列,分别设计合成两对引物,PCR扩增gh和vp28基因,将基因gh和vp28按先后次序融合后插入穿梭质粒pPIC6αC多克隆位点,构建成重组分泌表达穿梭质粒pPIC6αC-(gh+vp28),用Bstx1单酶切穿梭质粒pPIC6αC-(gh+vp28)线形化,转化毕赤酵母X-33。重组菌株30℃甲醇诱导,实现在酵母中的融合分泌表达,获得融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE检测和Western Blot印迹鉴定,显示与预期大小66kD相吻合的融合蛋白带。用Ni2+-柱纯化后的基因工程蛋白注射鳌虾进行蛋白生物功能测试,结果表明该蛋白获得了促鳌虾生长和抗WSSV感染的双重功效。
- 韩建山龙燕孟小林徐进平鲁伟王健
- 关键词：毕赤酵母促生长抗病毒
- 棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.6kb片段的表达被引量：13
- 2001年
- 以棉铃虫颗粒体病毒 (Helicoverpaarmigeragranulosisvirus ,简称HaGV)基因组的DNA为模板设计引物 ,PCR扩增病毒增效蛋白 (Enhanicn)基因 ,然后经BamHI/PstI双酶切消化 ,得到近乎全长的约 2 .6kb的增效蛋白基因片段 ,再与pQE32质粒连接 ,构建了重组表达载体pQE32 /En ,转化大肠杆菌M15 (pREP4 ) ,在IPTG诱导下表达出分子量约为 10 2kD的融合蛋白并命名为P10 2 ,纯化的P10 2 包涵体显示了明显的增效活性 ,在感染后 16 8h时统计可提高HaNPV对棉铃虫幼虫的感染死亡率 6 .2 5 %～ 2 7.0 9% ,缩短LT50 12 .3h以上 ;在感染后 72h时统计可提高Bt对棉铃虫幼虫的感染死亡率 2 8.18% ,缩短LT50 12 .33h。
- 胡蓉孟小林徐进平王健鲁伟
- 关键词：克隆生物活性测定
- 对虾肽Penaeidin-2在大肠杆菌中的融合表达及其抗细菌活性被引量：5
- 2006年
- 采集南美白对虾血淋巴,从血细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码penaeidin-2成熟肽的开放阅读框cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体,进行序列测定,然后克隆至pET-32a(+)表达载体中,在E.coliOriga-mi B(DE3)pLysS中表达含6个His的重组对虾肽融合蛋白Pen-24,通过His Band resin Ni2+层析柱纯化获得Pen-24蛋白,采用纸片扩散法和液体生长抑制法检测该蛋白的抑菌活性.经SDS-PAGE分析,Pen-24蛋白的分子量为24.1×103.1μg对虾肽融合蛋白Pen-24与5 U的氨苄青霉素活性相当,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素大肠杆菌均具有抑菌活性.
- 付百玲徐进平孟小林王健鲁伟
- 关键词：对虾原核表达抗菌活性
- 重组人白介素-12在银纹夜蛾中的表达纯化及其生物活性被引量：3
- 2002年
- KB细胞经PDBu刺激 ,采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA ,RT PCR法获得重组人白介素 12 (rhIL 12 )P35和P4 0cDNA。将hIL 12P35cDNA和P4 0cDNA分别克隆到 pAcUW 5 1载体的Polyhedrin和P10启动子下游 ,构建 pAcUW 5 1 IL12转移载体。pAcUW 5 1 IL12与坏死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染Sf9细胞 ,获得重组杆状病毒Ac hIL12。该病毒经血腔感染银纹夜蛾幼虫 ,采用亲和层析法纯化rhIL 12 ;SDS PAGE(银染法 )、Westernblot鉴定表达和纯化的产物 ;ELISA检测rhIL 12含量 ;MTT法检测rhIL 12样品生物活性。rhIL 12分子量为 75kD。rhIL 12在Sf9细胞培养中表达水平为 17.8μg/10 6细胞 ;在银纹夜蛾幼虫中表达水平为 2 0 0 - 30 0mg/L血淋巴。纯化的重组rhIL 12样品对经PHA P激活的PBMC有明显的增殖活性 。
- 徐进平孟小林王健鲁伟
- 关键词：银纹夜蛾纯化生物活性
- 蚯蚓纤溶酶基因的cDNA克隆及其序列分析被引量：3
- 2004年
- 从粉正蚓成体中提取总RNA,以寡核苷酸Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一条链;用RT PCR的方法扩增蚯蚓纤溶酶的cDNA,将其克隆到pUCm T载体上进行DNA序列测定.结果表明,所克隆的蚯蚓纤溶酶cDNA长度为747bp,其中编码区段为738bp,共编码246个氨基酸.将该序列与GenBank中其它的4种蚯蚓纤溶酶序列(LumbricusrubellusEFE III 1、Lumbricusrubelluslumbrokinase 3(1)precursor、Lumbricusbimastuslumbroki nase、Lumbricusrubelluslumbrokinase 1T4precursor)相比,同源性分别为99%,97%,89%,88%;与同源性最高的序列相比,本序列有7个碱基、3个氨基酸与该序列不同.
- 胡燕孟小林徐进平张俊杰王健鲁伟
- 关键词：蚯蚓纤溶酶CDNA克隆RT-PCR血栓病
