李秦
- 作品数：9 被引量：35H指数：3
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- 发文基金：国家自然科学基金甘肃省生物技术专项甘肃省财政厅资助项目更多>>
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- HSPA9B在牦牛体外受精胚胎中的表达
- 2015年
- 本试验旨在研究热休克蛋白70-9B（heat shock 70 000protein-9B,HSPA9B）在牦牛早期体外受精胚胎中的表达差异及其与体外受精胚胎发育的关系。在正常生理条件下,采集青海高原牦牛卵巢,捡取质量良好的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）,进行体外受精和体外培养,采取实时荧光定量（RT-qPCR）和间接免疫荧光技术,检测HSPA9B在不同时期体外受精胚胎中的表达差异及其蛋白分布。实时荧光定量结果表明,HSPA9B在2~4细胞期胚胎中的相对表达量,分别是在桑椹胚和囊胚中的6.693 4、5.227 4倍,HSPA9B在4~8细胞期胚胎中的相对表达量分别是在2~4细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中的1.136 8、9.089 7和5.937 2倍。间接免疫荧光染色结果表明,在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的相对表达量较胞质弱,在囊胚中胞核HSPA9B的相对表达量较胞质强。由此得出结论：通过基因水平研究,发现HSPA9B在牦牛早期各时期的体外受精胚胎中存在表达差异,HSPA9B在2~4、4~8细胞期胚胎中的相对表达量与其在桑椹胚和囊胚中的相对表达量差异性极显著（P〈0.01）,提示：可能是HSPA9B在胚胎早期发育中发挥重要作用;通过蛋白水平研究,发现HSPA9B在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达弱,在囊胚中胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达强,结果表明,在体外培养的环境应激条件下,牦牛体外受精胚胎发育至囊胚时,HSPA9B蛋白的分布可能发生了移位。
- 吕鹏潘阳阳崔燕李秦何翃闳张译夫李谷月樊江峰余四九
- 关键词：牦牛体外受精胚胎实时荧光定量间接免疫荧光
- 牦牛孤雌激活胚胎在不同培养液中的发育及DNMT1基因的表达
- 为寻求较佳的牦牛胚胎培养液,本实验中将成熟的牦牛卵母细胞进行孤雌激活后置于SOFaa和G1/G2两种不同的培养液中进行发育培养,统计其在24h、48h、96h、120h和168h的胚胎发育情况,并采用实时荧光定量PCR....
- 李秦潘阳阳张译夫郑红飞吕鹏何翃闳崔燕余四九
- 关键词：牦牛卵母细胞孤雌激活DNMT1实时荧光定量PCR
- HSP27基因在母牦牛生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达
- 通过克隆牦牛热休克蛋白27(heat shock proteins27,HSP27)基因,分析其生物学特性,探讨正常生理条件下HSP27基因在繁殖周期母牦牛主要生殖器官及不同时期牦牛孤雌激活胚胎中的表达差异,来阐明HSP...
- 何翃闳潘阳阳李秦陈平温泽星李谷月蒋佳颖余四九
- 关键词：母牦牛繁殖周期孤雌激活胚胎HSP27生殖器官
- 牦牛HSP27基因的克隆及其在雌性生殖器官中的表达被引量：19
- 2015年
- 【目的】克隆牦牛热休克蛋白27(heat shock proteins27,HSP27)基因,分析其生物学特性,研究正常生理条件下HSP27基因在母牦牛主要生殖器官中的表达差异。【方法】采取卵泡期后期、黄体期后期同侧的卵巢、输卵管和子宫,以及妊娠期早期(胚胎约长2.3cm)妊娠侧的卵巢、输卵管和子宫组织,以其c DNA为模板,利用RT-PCR扩增牦牛HSP27基因,并将纯化的PCR产物克隆到p MDTM18-T Vector载体中进行测序;利用生物信息学软件对HSP27基因的特征进行生物信息学分析,预测功能结构域;采用实时荧光定量RT-q PCR测定繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的相对表达量,用SPSS19.0软件对试验数据进行差异显著性分析。【结果】成功克隆出包含完整编码区的牦牛HSP27基因序列,其编码区长450bp(Gen Bank登录号:KP716832),可编码149个氨基酸,其中含量最高的是亮氨酸Leu(10.7%),含量最低的是色氨酸Trp(0.7%)。HSP27编码区蛋白原子个数为2 366,分子式为C747H1189N205O220S5,分子量为16.722k D,理论等电点为5.33;HSP27编码蛋白为非跨膜可溶性蛋白。同源性分析显示,牦牛HSP27基因的核苷酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的核苷酸序列同源性分别为99.8%、98.4%、97.8%、97.6%、90.3%、89.7%、89.7%、86.7%、86.7%、85.5%和85.3%,牦牛HSP27基因的氨基酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的氨基酸序列同源性分别为100%、100%、100%、100%、96.3%、100%、96.8%、100%、100%、96.3%和96.3%;系统进化树表明,牦牛HSP27基因与家牛、印度水牛、绵羊和藏羚羊的进化水平较为相近,与灰狼、猩猩和人类的较远。RT-q PCR结果表明,牦牛HSP27基因在卵泡期、黄体期、妊娠期不同时期的卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达,其中在卵泡期卵巢中的表达量最高,在黄体期子宫中�
- 何翃闳崔燕潘阳阳樊江峰胡威张译夫刘鹏刚李秦余四九
- 关键词：牦牛HSP27基因克隆生物信息学
- 两种培养液对牦牛孤雌激活胚胎发育及DNMT1基因表达的影响被引量：2
- 2015年
- 为寻求较佳的牦牛胚胎培养液,将成熟的牦牛卵母细胞进行孤雌激活后分别置于培养液SOFaa和G1/G2中进行发育培养,观察培养开始后第24、48、96、120和168小时胚胎的发育情况,并采用实时荧光定量PCR检测DNMT1基因的表达量。结果显示,SOFaa液中2-4细胞胚胎、4-8细胞胚胎、9-16细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的发育率分别为87.50%、68.00%、40.00%、34.29%、12.86%;而G1/G2联合培养液中2-4细胞胚胎、4-8细胞胚胎、9-16细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的发育率分别为89.33%、81.33%、58.67%、49.33%、17.14%。胚胎中DNMT1基因在G1/G2联合培养液中的表达量显著高于SOFaa液中的表达量。以上结果表明,G1/G2联合培养液可通过调控DNMT1基因的表达而提高胚胎发育率,可作为牦牛胚胎体外培养的较佳培养液。
- 李秦潘阳阳张译夫郑红飞吕鹏何翃闳崔燕余四九
- 关键词：牦牛卵母细胞孤雌激活DNMT1基因
- EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中的表达及对胚胎发育能力的作用被引量：14
- 2015年
- 【目的】探明表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)及其受体(EGFR)在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达动态,并且研究EGF对牦牛卵母细胞成熟的影响及可能的分子作用机制。【方法】采集牦牛卵巢,捡取质量较好的牦牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs),进行体外成熟培养;分别处理未成熟和成熟的牦牛COCs,采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟过程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表达动态;牦牛COCs成熟培养时在基础培养基中分别添加0、50、100和200 ng·m L-1 EGF及最佳作用浓度的EGFR抑制因子Gefitinib,比较作用前后卵母细胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率;Real-time PCR方法分析不同浓度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相关基因Bax和Baxi的相对表达量。【结果】EGF,EGFR基因在成熟COCs的表达显著高于未成熟COCs,成熟COCs中EGF基因的相对表达量为未成熟COCs的2.17±0.36倍,EGFR基因在成熟COCs的表达量为未成熟COCs 6.82±0.21倍,且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表达量均显著高于EGF。免疫荧光检测显示未成熟COCs和成熟COCs均表达EGF和EGFR蛋白,EGF和EGFR蛋白的标记荧光主要集中在卵丘细胞,卵母细胞表达较弱。100 ng·m L-1 EGF可以显著提高COCs成熟率(73.45±2.09)%及其受精后的卵裂率(59.46±1.41)%和囊胚率(26.23±1.08)%;对照组中(0 EGF)COCs成熟率为(54.16±3.25)%,卵裂率为(48.33±1.93)%,囊胚率为(15.34±0.43)%;EGF浓度为50 ng·m L-1时成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%;200 ng·m L-1成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(71.26±4.18)%、(57.13±2.06)%和(23.96±0.53)%;而加入EGFR抑制因子Gefitinib显著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率,分别为(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟过程中EGF的作用可以显著抑制促凋亡基因Bax的表达,在50 ng·m L-1、100 ng·m L-1、200
- 潘阳阳李秦崔燕樊江峰杨琨何俊峰余四九
- 关键词：牦牛卵母细胞体外成熟
- 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响被引量：3
- 2018年
- 为了探讨金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比（MOI）为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点（P〈0.5）;在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点（P〈0.5）;在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点（P〈0.5）。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点（P〈0.5）;在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点（P〈0.5）;在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点（P〈0.5）。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。
- 赵凌潘阳阳何翃闳李秦樊江峰王萌崔燕余四九
- 关键词：金黄色葡萄球菌大肠杆菌乳腺上皮细胞实时荧光定量PCR
