孔令严
- 作品数：10 被引量：36H指数：3
- 供职机构：湖北省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 克氏原螯虾病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏与黏附特性被引量：25
- 2016年
- 为了明确安徽省当涂县淡水养殖克氏原螯虾暴发性疾病的病原,取濒临死亡的病虾分离病原。从肝胰腺中分离到一株优势细菌（命名为XLX1分离株）,人工感染试验证实其具有较强的致病性;采用形态学检查、生理生化特性测定和细菌16S r RNA基因序列分析,确定XLX1分离株为弗氏柠檬酸杆菌。进一步对XLX1分离株进行药物敏感性、携带黏附素基因情况和细胞黏附性进行检测。结果显示：该分离株对头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、替考拉宁和米诺环素敏感或中敏,对其他7种测试药物呈现耐药。该分离株携带黏附素基因cfa和ure基因簇;序列分析发现ure ABC结构基因和ure D关键辅助基因高度保守,在虾源分离株与人源参考株间前者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在93.2%～98.3%和91.7%～97.4%,后者的核苷酸和氨基酸序列同源性分别在90.8%～98.3%和94.7%～98.7%;与人源参考株相比,虾源分离株Ure ABC结构蛋白中第294、600和608位氨基酸,以及Ure D蛋白中的第62和122位氨基酸发生了有意突变。XLX1分离株可以聚集方式黏附于EPC细胞周围,平均黏附菌数为29.8±5.3,但随黏附时间延长,EPC细胞出现病变。上述研究结果可为防控弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物疾病提供理论依据。
- 肖宁孔令严周昊曹际李槿年相翊卿王蒙蒙
- 关键词：克氏原螯虾药敏性黏附性
- 体外诱导禽巴氏杆菌链霉素耐药株及耐药机制的初步分析被引量：1
- 2018年
- 为了研究多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)对链霉素(Streptomycin,Str)药物敏感性变化及其耐药机制,采用体外诱导法对禽源Pm亲本敏感株(C48-1)进行诱导后成功获得Str耐药株,并对Str耐药株的最小抑菌浓度(MIC)、生化特性、生长曲线、耐药稳定性、耐药基因点突变以及耐药逆转性进行了研究。结果表明,与亲本株相比,Str耐药株生化特性与生长曲线无显著差异,MIC值由8μg/m L上升至1 024μg/m L;发现耐药基因Str A、Str B,且核糖体基因rps L编码的氨基酸发生了Lys43→Thr突变;耐药逆转性试验中羰基氰氯苯腙(CCCP)将Str耐药株MIC值降为16μg/m L。逐步递增药物浓度可以诱导禽源Pm对氨基糖苷类药物的耐药性,其耐药机理为磷酸转移酶类对氨基糖苷类抗生素结构的修饰作用,核糖体靶位点突变和外排泵的过量表达。
- 汪最孔令严邵华斌卢琴罗青平杨玉莹
- 关键词：体外诱导链霉素位点突变耐药机制
- 具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用
- 本发明涉及具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用。本拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成。而多肽组合物则由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2以...
- 李槿年戚莉芳孔令严高会会侯立婷
- 文献传递
- 拟态弧菌VMH蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备被引量：2
- 2016年
- 目的实现拟态弧菌热不稳定性溶血素(VMH)的原核表达,制备兔抗VMH蛋白的多克隆抗体。方法根据GenBank上已有的拟态弧菌vmh基因序列,设计并合成引物,通过PCR方法扩增vmh基因。PCR纯化产物酶切后,定向插入到PET-32a表达载体构建重组表达质粒PET-32a-vmh。重组表达质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下进行VMH蛋白表达。SDS-PAGE分析重组VMH蛋白(rVMH)的表达形式,并分别采用兔血平板扩散法和Western blot检测其溶血活性和免疫反应性。用纯化的rVMH蛋白免疫新西兰大白兔,3次免疫后采集免疫血清,采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法纯化多克隆抗体,并检测其纯度与效价。结果重组表达质粒PET-32a-vmh诱导表达后,经SDS-PAGE分析发现分子量约为77.8kDa的rVMH蛋白主要以包涵体形式表达,该蛋白经变性复性后具有溶血活性和免疫反应性。兔抗rVMH蛋白的多克隆抗体经纯化后,其纯度达95%,ELISA效价为1∶26843545600,琼扩效价为1∶32。结论成功制备了rVMH蛋白及其多克隆抗体,为进一步采用噬菌体肽库筛选技术鉴定VMH蛋白表位提供了物质基础。
- 肖宁曹际孔令严周昊陶会竹陶丽寒李槿年
- 关键词：拟态弧菌原核表达多克隆抗体
- 禽巴氏杆菌四环素耐药株转录组测序与分析被引量：2
- 2019年
- 为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(avian Pasteurella multocida,Pm)四环素(Tetracycline,Tet)敏感株与耐药株(MIC=32μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Tet敏感株与耐药株进行双向测序,通过GO、KEGG和ARDB数据库对表达差异基因进行注释和富集性分析。结果显示,共筛选出442个差异表达基因,其中包括103个上调基因和339个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数富集于核糖体结构成分、rRNA结合、跨膜运输和离子转运等生物过程;对差异表达基因进行信号通路富集性分析,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与核糖体代谢途径中;对差异表达基因进行耐药基因注释(ARDB),发现其中的耐药基因主要为核糖体保护蛋白和外排系统两类。本研究表明禽源Pm对四环素耐药的耐药机制可能与细胞膜上ABC转运蛋白的过量表达以及核糖体保护蛋白有关。
- 孔令严汪最邵华斌邵华斌卢琴张腾飞
- 关键词：转录组测序
- 禽巴氏杆菌环丙沙星耐药株转录组测序与分析被引量：5
- 2017年
- 为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(Avian Pasteurella multocida,Pm)敏感株与环丙沙星(Cip)耐药株的差异表达基因,本研究采用高通量转录组测序的RNA-seq技术对敏感株与Cip耐药株进行检测,参考Pm70株基因组(NC_002663.1)进行拼接与质量评估,测序数据处理后获得表达差异基因,利用GO和KEGG数据库对表达差异基因进行注释与富集性分析,并利用荧光定量PCR对转录组测序中的差异表达基因进行验证。结果显示,所有样品测序数据参考Pm70全基因组匹配率均达到95.87%以上,对基因差异表达进行分析后鉴定得到19个差异表达基因,其中15个上调,4个下调。通过GO功能富集分析显示差异表达基因主要为转运运输功能,并对差异表达基因进行信号通路富集性分析,结果表明最具代表性的信号通路为"ABC转运蛋白"(ko02010)。推测禽源Pm中的ABC转运蛋白超家族可能在Cip耐药机制中具有重要作用。
- 孔令严罗青平卢琴邵华斌李槿年
- 关键词：耐药机制
- 体外诱导禽巴氏杆菌环丙沙星耐药株及耐药机制的初步分析被引量：1
- 2017年
- 为了探讨在环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)药物培养后,多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)对CIP的药物敏感性变化及其耐药机制,试验采用体外递增药物浓度的方法诱导出禽源Pm标准株C48-1对CIP的耐药菌株,并对CIP耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)值变化及耐药稳定性、生化特性、生长曲线和基因组位点突变进行了研究。结果表明:诱导的CIP耐药菌株的MIC由0.25μg/mL上升至16μg/mL;与亲本株比较,生化特性与生长曲线无显著差异,但诱导株的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)gyrA基因编码的氨基酸发生了Thr99→Ala的变化,该位点突变首次发现,gyrB、parC、parE耐药基因均未发生变化。说明逐步递增药物浓度可以诱导禽源Pm对氟喹诺酮类药物的耐药性,并导致靶基因发生突变。
- 孔令严李槿年卢琴邵华斌罗青平
- 关键词：体外诱导环丙沙星位点突变耐药机制
- 具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用
- 本发明涉及具有黏附拮抗活性的拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽、多肽组合物及其应用。本拟态弧菌OmpU黏附素蛋白结合肽由氨基酸序列SEQIDNO:1组成。而多肽组合物则由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2以及SEQID...
- 李槿年戚莉芳孔令严高会会侯立婷
- 文献传递
- 禽多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的初步建立被引量：3
- 2015年
- 禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)是引起禽霍乱的一种病原菌,能快速引起家禽的败血症等一系列病症,给我国的家禽业造成了巨大的经济损失。试验通过在Gene Bank中查询禽多杀性巴氏杆菌的全基因组序列,从而找到PM的保守序列,运用Primer5设计引物,常规PCR后得到目的核酸扩增产物。经过敏感性、特异性、干扰性等试验确定了该方法的特异性和稳定性。结果证明该方法特异性强,敏感性高,干扰性极低,并且与生化鉴定得出的结果有较高的符合率。该方法简单易操作,适合广泛应用于临床以检测禽多杀性巴氏杆菌病。
- 闫瑞雪罗青平汪辉董俊孔令严刘国平
- 关键词：PCR检测敏感性
- 禽多杀性巴氏杆菌耐药株的转录组学分析
- 禽多杀性巴氏杆菌是一种严重危害养禽业的病原菌，能够引起家禽和野生鸟类禽霍乱。近年来由于养殖业的广泛且不合理的使用抗菌药物，禽多杀性巴氏杆菌的多重耐药现象日趋严重，导致患病家禽大批死亡，给养殖业造成巨大的经济损失。因此，开...
- 孔令严
- 关键词：禽多杀性巴氏杆菌转录组学分子机制
- 文献传递
