李昕
- 作品数：12 被引量：42H指数：5
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- REV7基因对人结肠癌细胞周期及凋亡的影响
- 2018年
- 目的探讨下调REV7基因对人结肠癌细胞HCT116、SW620细胞周期及凋亡的影响。方法通过体外培养人结肠癌细胞株HCT116、SW620,用REV7基因的特异性si RNA片段转染细胞,运用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹技术检测转染后细胞系的REV7基因干扰效率。选择REV7低表达具有统计学意义的上述细胞系作为实验组细胞,同时将加入转染试剂的HCT116、SW620细胞作为空白对照组,转染阴性RNA oligo干扰片段的HCT116、SW620细胞作为阴性对照组。采用流式细胞术测定各组细胞的细胞凋亡情况。通过Western blot法检测各组细胞抑癌蛋白P53、细胞周期蛋白P21、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、细胞凋亡蛋白BAK、BCL-XL表达水平。结果实时荧光定量PCR结果显示,HCT116、SW620细胞中si REV7干扰效率均高于60%(P<0.01);Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡结果显示,实验组与阴性对照相比,REV7下调促进HCT116、SW620细胞凋亡(P<0.05);Western blot结果显示,低表达REV7可下调HCT116、SW620细胞抗凋亡蛋白BCL-XL、细胞周期蛋白P21蛋白表达水平(P<0.01),上调促凋亡蛋白BAK、肿瘤抑制蛋白P53、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4蛋白表达水平(P<0.01)。结论下调REV7可以阻滞结肠癌细胞HCT116、SW620细胞周期并促进细胞凋亡,其机制可能与下调REV7后,引起抑癌蛋白P53、蛋白细胞周期蛋白CDK4、P21及细胞凋亡蛋白的BAK、BCL-XL的表达变化有关。
- 孙昊彤马璐赵晓鹏李昕隋御徐方
- 关键词：结肠癌细胞周期细胞凋亡DNA损伤修复
- TNF-α激活Wnt信号通路促进人结肠癌干细胞侵袭被引量：10
- 2018年
- 目的探讨炎症环境下Wnt信号通路对人结肠癌干细胞侵袭的影响。方法以人结肠癌细胞系HT29细胞为材料,用流式细胞荧光分选技术(FACS)分选CD44+CD133+的人结肠癌干细胞;流式细胞术及单细胞克隆形成实验对分选出的干细胞进行鉴定;肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理CD44+CD133+HT29细胞建立炎症细胞模型,噻唑蓝(MTT)实验筛选TNF-α作用的最适剂量及最佳作用时间; Wnt信号通路抑制剂Dickkopf相关蛋白1(DKK1)作用于CD44+CD133+HT29炎症细胞,实验分为空白组、TNF-α处理组、加DKK1的TNF-α处理组。MTT实验检测各组细胞增殖情况,Western blot法检测Wnt信号通路中相关蛋白β联蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、c-Myc及上皮间质转化(EMT)相关蛋白上皮钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达情况,TranswellTM侵袭实验检测各组细胞侵袭情况。结果流式细胞分选术成功分选出结肠癌CD44+CD133+HT29干细胞。MTT实验筛选出TNF-α作用的最适剂量为10 ng/m L,最佳作用时间为48 h。与空白组相比,TNF-α处理组中CD44+CD133+HT29细胞的相对存活率增加,TranswellTM穿膜的细胞数增加,β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达升高,E-cadherin表达降低、vimentin表达升高;与TNF-α处理组相比,加DKK1的TNF-α处理组CD44+CD133+HT29细胞的相对存活率降低,TranswellTM穿膜细胞数减少,β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达降低,E-cadherin表达升高、vimentin表达降低。结论TNF-α通过激活Wnt信号通路促进结肠癌干细胞的侵袭能力。
- 魏笑李昕孔飞飞马璐隋御陈冬梅徐方
- 关键词：结肠癌干细胞WNT信号通路HT29细胞
- MMS2和P53基因对结肠癌细胞增殖与凋亡的影响被引量：5
- 2016年
- 目的:探讨MMS2 siRNA与P53 siRNA对人高分化结肠癌细胞(THC-8307)的增殖与凋亡的相互调控作用。方法:以实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白印迹法(Western blot)分析检测细胞转染效率,选择沉默效率具有统计学意义的THC-8307细胞作为实验组,同时将未作处理的THC-8307作为空白对照,转染空质粒细胞作为阴性对照。采用qRT-PCR及Western blot分别检测干扰各组目的基因后其两基因相互关系及表达量。采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,以明确其对结肠癌细胞增殖与凋亡的作用。结果:实验组与对照组相比,分别沉默MMS2基因与P53基因的结肠癌细胞内P53与MMS2的mRNA与蛋白水平显著升高(P<0.05)。沉默MMS2实验组其早期凋亡与晚期凋亡率增加(P<0.05)。结论:MMS2和P53在结肠癌细胞增殖与凋亡方面起反向调控作用。
- 马琳园隋御马璐李昕李元杰徐方
- 关键词：P53RNA干扰人结肠癌细胞细胞凋亡
- α-硫辛酸对小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤和凋亡的影响被引量：4
- 2016年
- 目的探讨α-硫辛酸对小鼠颗粒细胞培养过程中抗氧化水平和抗凋亡水平的影响。方法收集经PMSG处理的小鼠卵巢颗粒细胞,经原代培养24h后,添加终浓度为100μmol/L的α-硫辛酸继续培养24h,测定氧化水平SOD、MDA和GSH-Px参数,评价抗氧化能力,采用Trizol法提取各组细胞的RNA,进行RT-PCR法检测α-硫辛酸对caspase-3和caspase-9基因的表达情况的影响,同时利用细胞免疫荧光和ELISA法检测caspase-3和caspase-9蛋白表达,并分析α-硫辛酸降低细胞凋亡的作用。结果分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞α-硫辛酸添加后,SOD和GSH-Px活性升高,MDA含量降低(P<0.05);经过RT-PCR扩增技术获得长度为180bp的特异性caspase-3产物,获得长度为152bp的特异性caspase-9产物,α-硫辛酸添加可显著性降低caspase-3和caspase-9mRNA的表达(P<0.05);免疫荧光细胞化学染色显示颗粒细胞caspase-3和caspase-9蛋白阳性染色定位于细胞胞质,分别呈现绿色荧光和红色荧光,细胞核呈蓝色荧光;ELISA结果显示α-硫辛酸添加后caspase-3和caspase-9酶活性显著下调(P<0.05)。结论小鼠颗粒细胞培养过程中添加α-硫辛酸可明显改变细胞抗氧化能力,对卵巢颗粒细胞培养过程中的氧化应激诱导的细胞凋亡起到一定的保护作用。
- 马会明张永芳王蒙蒙李昕王永峰田洪成裴秀英王燕蓉
- 关键词：Α-硫辛酸氧化应激卵巢颗粒细胞小鼠
- 单次热应激对小鼠睾丸增殖细胞的影响被引量：2
- 2015年
- 目的明确单次热应激对小鼠睾丸增殖细胞的影响。方法 6周龄雄性C57小鼠36只,随机分为热处理组和对照组。小鼠热处理组单次43℃水浴,干预15 min,于1、7和14 d取材,HE染色观察睾丸结构形态,免疫组织化学染色检测增殖细胞定位及变化,Western Blot检测Ki67蛋白表达,并进行统计学分析。结果应激处理组生精小管排列疏松,曲细精管中细胞数量明显减少甚至消失,细胞散落在曲细精管中;免疫组化可见,增殖细胞呈现动态变化过程,单次热应激处理后1 d增殖细胞显著减少,第7、14天增殖细胞数量开始慢慢恢复;Western Blot可见KI-67表达量在热应激处理后7 d表达量显著降低,第14天表达量慢慢恢复,且各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论小鼠睾丸经43℃水浴单次热应激15 min后,增殖细胞的动态恢复是后期精子生成的结构基础。
- 田洪成马文智马会明蒲静杨晓霞张永芳王永峰王蒙蒙李昕马良宏裴秀英王燕蓉
- 关键词：热应激睾丸增殖细胞
- TNF-α通过激活PI3K/AKT通路促进SW620^Lgr5+结肠癌干细胞增殖被引量：7
- 2020年
- 目的探讨炎症环境下磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)通路对SW620^Lgr5+结肠癌干细胞(CSC)增殖的影响。方法以人结肠癌SW620、 SW480、 HT29、 HCT116细胞为材料, Western blot法检测四株细胞中干细胞标志物富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)的表达水平;选用Lgr5表达量最高的SW620细胞,采用荧光激活细胞分选技术(FACS)分析Lgr5^+细胞的比例;无血清悬浮培养得到结肠癌球细胞, FACS分选获得结肠癌Lgr5^+ CSC,集落形成实验、 5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药实验鉴定分选得到的结肠癌Lgr5^+CSC生物学特征的变化;肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理Lgr5^+ CSC建立炎症模型, CCK-8法筛选TNF-α的最适作用浓度及最佳作用时间;采用PI3K/AKT通路抑制剂MK2206处理Lgr5^+ CSC,分为空白对照组、 MK2206组、 TNF-α组、 MK2206联合TNF-α组;集落形成实验检测细胞增殖情况,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β)蛋白水平。结果 SW620细胞中Lgr5的蛋白表达量显著高于其他细胞系;FACS分析得到SW620细胞中Lgr5^+细胞比例为6.9%,无血清培养基悬浮培养后,分选得到SW620^Lgr5+ CSC的比例为34.5%;与SW620细胞相比, SW620^Lgr5+ CSC的增殖能力与耐药性显著提高;1 ng/mL TNF-α作用24 h时,SW620^Lgr5+ CSC具有最高的细胞活力;与对照组相比, TNF-α显著增加SW620^Lgr5+ CSC的集落形成能力,但MK2206显著性降低SW620^Lgr5+ CSC的集落形成能力,增加SW620^Lgr5+ CSC的凋亡率;同时MK2206显著降低TNF-α诱导的SW620^Lgr5+ CSC的集落形成能力,增加其凋亡比例。TNF-α处理增加SW620^Lgr5+ CSC中AKT和GSK-3β的磷酸化水平,但MK2206可抑制TNF-α诱导的AKT和GSK-3β的磷酸化水平。结论 TNF-α通过激活PI3K/AKT信号通路促进SW620^Lgr5+ CSC增殖。
- 戴璐赵晓鹏马璐李昕左娣李元杰魏波隋御徐方
- 关键词：TNF-Α细胞增殖
- 小鼠Akt基因真核表达载体的构建及鉴定
- 2018年
- 目的构建含有小鼠Akt基因以及绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pDoubleEx-EGFPAkt1。方法以小鼠卵巢RNA为模板,通过RT-PCR扩增Akt,并将其克隆到pDoubleEx-EGFP载体中。通过酶切和测序鉴定,构建真核表达载体pDoubleEx-EGFP-Akt1。之后转染人卵巢癌上皮细胞SKOV-3。结果经测序鉴定,构建的Akt基因序列与野生型Akt序列完全相符。将pDoubleEx-EGFP-Akt1转染进入人卵巢癌上皮细胞SKOV-3,观察到稳定转染后的细胞有明显绿色荧光蛋白表达。结论成功构建含有小鼠Akt基因的真核表达载体pDoubleEx-EGFP-Akt1,为进一步研究Akt基因的功能提供初步的实验基础。
- 蒲静俞晓丽马会明李昕王蒙蒙
- 关键词：真核表达载体转染
- 雌激素对卵巢颗粒细胞雌激素受体-β和转录因子叉头蛋白3表达的影响被引量：6
- 2016年
- 目的探讨雌激素(E2)对雌激素受体-β(ER-β)与转录因子叉头蛋白3(FoxO3)的表达及其对卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响。方法利用添加1μmol/L的E2或100 nmol/L ICI182.780的TCM199培养基体外培养卵巢颗粒细胞;采用WST比色法检测不同培养条件下卵巢颗粒细胞的增殖;RT-PCR和Real-time PCR检测ER-β与FoxO3 mRNA的表达,采用细胞免疫荧光和Western blotting检测ER-β与FoxO3的表达。结果 E2能促进卵巢颗粒细胞增殖,而ICI182.780抑制卵巢颗粒细胞增殖;RT-PCR扩增结果与理论值符合,Real-time PCR结果显示,ICI182.780与E2比较,ER-βmRNA表达下调,FoxO3 mRNA表达上调(P<0.05);Western blotting法结果显示,ER-β和FoxO3蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),灰度值分析显示添加E2中ER-β蛋白表达升高,FoxO3蛋白下降(P<0.05),添加ICI182.780中的ER-β表达下调,FoxO3表达上调,与E2比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 E2可提高ER-β的表达,降低FoxO3的表达,影响卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡。
- 马会明张永芳王蒙蒙李昕王永峰田洪成胡蓉王燕蓉裴秀英徐仙
- 关键词：雌激素雌激素受体-Β卵巢颗粒细胞
- 重组蛋白GDF-9对卵巢黄素化颗粒细胞增殖和凋亡的影响被引量：4
- 2016年
- 目的探讨重组生长分化因子-9(GDF-9)对人卵巢黄素化颗粒细胞周期及细胞增殖、凋亡的影响。方法收集因输卵管和(或)男性因素而接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗患者的卵泡液进行密度梯度离心,收集黄素化颗粒细胞,接种于M199培养基进行原代培养,实验组在M199培养基中添加100ng·m L-1GDF-9因子,对照组未添加GDF-9因子;培养48h后,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖情况;用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡;Western blot法检测裂解的半胱氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase-3)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及其磷酸化表达水平。结果原代培养的人黄素化颗粒细胞在培养第2~4天时处于分裂增殖高峰期,贴壁培养24h再添加GDF-9因子作用48h后,细胞周期检测结果显示,GDF-9使颗粒细胞周期表现为GO/Gl期的比例明显减少,S+G2/M期的比例明显增高(P<0.05)。细胞凋亡检测结果显示,颗粒细胞凋亡率显著减少(P<0.05)。Western blot检测发现,添加GDF-9使cleaved-caspase-3蛋白的相对表达量降低,磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的相对表达量显著增高(P<0.05)。结论重组GDF-9因子可促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡,其机制可能与活化ERK和抑制cleaved-caspase-3途径、调节细胞周期有关。
- 马会明李昕王蒙蒙王永峰田洪成王飞苗王燕蓉裴秀英
- 关键词：生长分化因子-9细胞外信号调节激酶1/2颗粒细胞卵巢
- 二甲双胍通过抑制核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(P70S6)调节体外人颗粒细胞胰岛素受体底物-1(IRS-1)的表达被引量：5
- 2015年
- 目的:探讨二甲双胍对核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(P70S6k)及胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白及其ser307位点磷酸化表达的影响。方法:利用0.1 mmol/L二甲双胍体外连续作用多囊卵巢综合症(PCOS)患者黄素化颗粒细胞24 h为实验组,设未加二甲双胍培养的颗粒细胞为对照组。通过RT-PCR和Real-time PCR检测P70S6k和IRS-1的表达,细胞免疫荧光化学和Western blotting的方法检测P70S6k、p-thr389-P70S6k、IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白的表达。结果:Real-time PCR结果显示实验组P70S6k和IRS-1m RNA水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫荧光化学检测IRS-1和p-ser307-IRS-1蛋白在颗粒细胞胞质表达,P70S6k和p-thr389-P70S6k蛋白在细胞核表达。Western blotting法结果显示二甲双胍作用24 h前、后卵巢颗粒细胞P70S6k、p-thr389-P70S6k、IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表达有统计学差异(P<0.05),灰度值分析显示添加二甲双胍组P70S6k、p-thr389-P70S6k蛋白表达显著升高,IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表达显著下降(P<0.05)。结论:二甲双胍可抑制人颗粒细胞P70S6k的表达,并通过Akt/P70S6k/IRS途径调节IRS-1的表达,从而增加颗粒细胞胰岛素的敏感性。
- 张永芳王蒙蒙李昕王永峰裴秀英王燕蓉马会明徐仙
