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短发夹RNA沉默hTERT基因对人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用被引量：17: 2006年; 背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象。RNAi在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道。但对喉癌等头颈恶性肿瘤中高表达的人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因,目前尚未见报道。本课题利用RNAi技术,研究短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)抑制hTERT基因表达对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用。方法:根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA。建立人喉癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型。将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤组织内的表达;以HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变;以原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况;以免疫组化SP法检测hTERT蛋白在肿瘤内的表达;光镜下观察心、肝、肾、脾结构的改变并测量血液学和血液生化指标。结果:pshRNA组(A组)、空质粒载体组(B组)与生理盐水组(C组)之间比较,A组与C组瘤体积有显著性差异(P<0.01),B组与C组之间瘤体积无显著性差异(P>0.05),抑瘤率为76.50%。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光。病理学检查及TUNEL检测发现:A组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂相少见,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡,该组肿瘤细胞的凋亡指数[(26.47±4.25)%]明显高于B组[(3.40±1.41)%]和C组[(2.73±1.35)%]。给予pshRNA后瘤体内hTERT蛋白表达明显下调,而且对心、肝、肾、脾无明显损害,对造血系统无影响。结论:表达shRNA的DNA载体质粒沉默hTERT基因可显著抑制人喉癌裸鼠肿瘤的生长,而且对心、肝、肾、脾及造血系统无明显的毒副作用。; 刘丹陶泽璋肖伯奎陈始明池花明; 关键词：喉肿瘤短发夹RNA HTERT

阳离子卟啉光动力疗法作用于人喉癌Hep-2细胞的实验研究被引量：2: 2005年; 目的:探讨阳离子卟啉对人喉癌Hep2细胞的光动力疗法(PDT)的作用。方法:采用4甲酰基苯甲酸甲酯和4吡啶甲醛经化学反应合成阳离子卟啉(5[4[1(4苯基哌嗪基)乙酰氧羰基]苯基]10,15,20三(4N甲基吡啶盐)卟啉,三碘盐)。以倒置显微镜下观察细胞生长状态,应用四唑盐比色(MTT法)和原位末端标记技术(TUNEL)分别研究阳离子卟啉在不同浓度(0、10-7、10-6、10-5mol/L)及不同时间(0、0.5、1.0、1.5、2.0h)高压汞灯照射下对人喉癌Hep2细胞的生长抑制和诱导凋亡作用。结果:在一定浓度范围内,阳离子卟啉对Hep2细胞生长增殖的抑制作用和诱导凋亡作用随着浓度和光照时间的增加而增强。最高浓度(10-5mol/L)及不同光照时间下Hep2细胞生长抑制率分别为1.18%、35.21%、58.59%、70.42%、84.34%,诱导的细胞凋亡率分别为3.30%、29.41%、32.30%、34.52%。大剂量和高能量照射可直接导致少量细胞坏死,随着光照时间的延长,未加卟啉的对照组对细胞生长亦有一定的抑制作用。结论:阳离子卟啉在高压汞灯的照射下能抑制体外培养的Hep2细胞生长增殖并诱导部分Hep2细胞凋亡,其治疗效果在一定浓度范围内与用药剂量和照射能量相关。; 严福波陶泽璋贾涛肖伯奎池花明陈始明; 关键词：光动力作用喉肿瘤凋亡

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究被引量：2: 2005年; 目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用.方法根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3.构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4.实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液).酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1～3.采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA 法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用.结果(1)质粒pshRNA1～3 SalⅠ酶切后电泳见400 bp小带,与预期插入的目的基因大小一致.共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光.(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0.159±0.039、B组细胞活性为0.163±0.028、E组细胞活性为1.512±0.076.A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0.01.同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高.结论 (1)靶向hTERT mRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染 Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡.; 陈始明陶泽璋肖伯奎潘松刘丹池花明; 关键词：端粒末端转移酶双链RNA

短发夹RNA抑制喉癌细胞hTERT基因表达及诱导细胞凋亡被引量：1: 2006年; 目的:探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达及诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法:构建靶向hTERTmRNA的质粒pshRNA1、pshRNA2及对照质粒pshRNA3、pEGFP,并将其分别转染喉鳞癌Hep-2细胞。共聚焦荧光显微镜观察质粒转染及表达情况;RT-PCR测定hTERTmRNA表达;Western印迹测定hTERT蛋白表达;末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定细胞端粒酶活性;MTT法研究细胞增殖活性变化;原位细胞凋亡(TUNEL)及透射电子显微镜研究细胞凋亡。结果:①共聚焦荧光显微镜下见大量的细胞呈现绿色荧光,与其他组比较,pshRNA1、2组呈现荧光的死亡细胞显著增加。②pshRNA1、2转染细胞后hTERTmRNA及hTERT蛋白表达显著降低;其端粒酶活性明显受到抑制:转染后2 d pshRNA1组活性为:0.159±0.039、pshRNA2组活性为0.163±0.028,与空白对照组1.523±0.076比较,差异有非常显著性(P<0.005)。③pshRNA1、2转染细胞后可显著抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。这两组细胞透射电镜可见典型细胞凋亡特征。结论:DNA载体途径的RNA干扰技术能有效抑制hTERT基因的表达及端粒酶活性并诱导癌细胞凋亡,此法可能成为抑制肿瘤细胞的新途径。; 陈始明陶泽璋池花明刘丹李志华詹汉章; 关键词：端粒末端转移酶 HEP-2细胞端粒酶逆转录酶

抑制端粒酶逆转录酶基因表达对C-myc蛋白表达的影响被引量：1: 2005年; 目的:探讨应用RNA干扰技术抑制Hep2细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Cmyc蛋白表达的影响。方法:根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1,随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA2,采用METAFECTENE作为转染试剂。分别以质粒pshRNA1、pshRNA2及空白培养液处理喉癌Hep2细胞。应用RTPCR法检测hTERT基因的表达,WesternBlot法检测hTERT和Cmyc蛋白表达水平。结果:质粒pshRNA1转染组hTERTmRNA及蛋白表达水平显著低于其他处理组及空白对照组(P<0.05);质粒pshRNA1转染组Cmyc蛋白表达水平显著高于其他处理组及空白对照组(P<0.01)。结论:RNA干扰抑制人端粒酶逆转录酶活性使喉癌Hep2细胞Cmyc蛋白表达升高,其确切的机制有待进一步研究。; 池花明陶泽璋陈始明肖伯奎詹汉章; 关键词：端粒酶逆转录酶基因表达喉肿瘤 C-MYC蛋白

RNA干扰hTERT基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究: 目的:探讨RNA 干扰人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用。材料与方法:根据hTERT cDNA 序列构建表达hTERT mRNA 特异的、含荧光素基因的shRNA 真核表达质粒pshRN...; 陈始明陶泽璋肖伯奎潘松刘丹池花明; 关键词：HTERT RNAI 喉肿瘤; 文献传递

抑制hTERT表达对喉癌细胞凋亡及其相关蛋白的影响被引量：4: 2006年; 目的探讨RNA干扰抑制端粒酶逆转录酶(human telomerase revese transcriptase,hTERT)对喉癌Hep-2细胞凋亡、P53及Caspase-3蛋白表达的影响。方法根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1,随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA2,采用METAFECTENE作为转染试剂。分别以质粒pshRNA1、pshRNA2及空白培养液转染喉癌Hep-2细胞。电镜下观测细胞凋亡小体的形成,TUNEL法检测细胞的原位凋亡,Western Blot法检测hTERT、P53、Caspase-3蛋白表达水平。结果pshRNA1转染组hTERT蛋白表达显著下调,大量Hep-2细胞凋亡,电镜显示凋亡小体形成。pshRNA1转染组P53和Caspase-3蛋白表达水平显著高于其他处理组及空白对照组(P<0.001),二者升高趋势具有相关性(相关系数r=0.088,P<0.05)。结论RNAi抑制hTERT基因表达能有效诱导喉癌细胞凋亡,其可能的分子机制是诱导P53及Caspase-3蛋白表达上调。; 池花明陶泽璋陈始明肖伯奎华清泉许昱; 关键词：喉肿瘤 HTERT RNAI CASPASE-3 细胞凋亡

短发夹RNA抑制hTERT基因治疗人喉癌裸鼠模型的实验研究: 目的:RNA 干扰（RNA interference,RNAi）是指双链RNA 导入细胞后诱导靶mRNA 发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象。RNAi 在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道。但对喉癌等头颈恶性...; 陶泽璋刘丹陈始明肖伯奎池花明; 文献传递

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