程琰
- 作品数：8 被引量：11H指数：2
- 供职机构：第三军医大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性被引量：3
- 2008年
- 目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。
- 程琰罗萍张卫军顾江邹全明毛旭虎
- 关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7融合蛋白免疫学活性
- 基于新月柄杆菌RsaA外运机制的EspA及EspA-IL-24融合蛋白胞外分泌表达研究
- 2008年
- 目的:实现大肠杆菌分泌蛋白(Esp)A及EspA与白细胞介素(IL)-24融合蛋白的胞外分泌表达,进一步验证基于新月柄杆菌RsaA外运机制的原核胞外分泌表达载体系统的有效性和通用性,并改造优化该系统。方法:利用分子克隆手段,按RsaA分泌系统操纵子组织方式,将获得的RsaA系统元件编码序列和异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒,构建新的胞外分泌表达质粒pQABP2S;以大肠杆菌为宿主菌诱导表达EspA及EspA-IL-24融合蛋白,并通过Westernblot检测目标蛋白在培养上清中的表达。结果:获得了新的胞外分泌表达载体pQABP2S;与对照相比,该载体宿主系统培养上清中目标蛋白EspA及EspA-IL-24的表达量明显增加。结论:在大肠杆菌中通过RsaA分泌系统可实现分子大小不同的EspA及EspA-IL-24融合蛋白的特异性分泌表达,进一步证实该分泌表达策略的有效性和通用性;调整调控序列以优化分泌系统的尝试,为此类基因工程技术平台的开发提供了借鉴。
- 宁亚蕾周立雄毛旭虎张卫军程琰余抒邹全明
- 关键词：白细胞介素-24分泌表达大肠杆菌
- 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒
- 本发明提供一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒，其包含SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸和PCR反应试剂。所述PCR试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，54.5℃退火20秒，72℃...
- 顾江方瑶王海光于波蒋明明程琰唐斌李娜毛旭虎
- 基于肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7 EspA的高效融合表达载体的设计、构建及应用研究
- 在生命科学研究和生物制药、生物制品的生产中,利用表达载体制备重组蛋白是重要而关键的环节,获得足够量的重组蛋白是进行后续研究和生产的必要条件。构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求,同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性...
- 程琰
- 关键词：原核表达载体融合蛋白
- 文献传递
- 原核融合表达载体的设计、构建及应用被引量：7
- 2008年
- 目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白。分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性。结果构建的表达载体pEspA可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白获得高效表达。先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合表达及纯化又提供了一种可供选择的工具。
- 程琰毛旭虎王庆旭余抒刘艳青张晓丽宁亚蕾邹全明
- 关键词：融合表达载体肠出血性大肠杆菌O157:H7
- 一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒
- 本发明提供一种用于鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的PCR试剂盒，其包含SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸和PCR反应试剂。所述PCR试剂盒的PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，54.5℃退火20秒，72℃...
- 顾江方瑶王海光于波蒋明明程琰唐斌李娜毛旭虎
- 文献传递
- 基于肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7 EspA的高效融合表达载体的设计、构建及应用研究
- 目的：构建基于EspA(肠出血性大肠杆菌O157：H7Ⅲ型分泌蛋白A)的高效原核融合表达载体，并对此载体的通用性和应用性进行研究。
方法：在EspA的羧基端设计-Lin-ker，包括柔韧区.肠激酶酶切位点和多克...
- 程琰毛旭虎王庆旭余抒刘艳青张晓丽宁亚蕾邹全明
- 关键词：大肠杆菌细菌感染免疫学检验蛋白表达
- 文献传递
- 类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157∶H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究被引量：1
- 2013年
- 目的融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质。方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性;EspA-FliC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性。结果获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319;实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度超过85%。Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157∶H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应。EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC。结论重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性。此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础。
- 于波方瑶顾江王海光程琰李倩唐彬李娜张小玲邹全明毛旭虎
