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牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用被引量：10: 2014年; 为建立一种快速诊断牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)病的方法,根据GenBank中登录的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计1对特异引物,优化反应体系后,建立了IBRV PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法可从IBRV DQ株中扩增出398 bp的特异性片段,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK细胞的扩增结果均为阴性。该方法检测IBRV的敏感性可达10-3 TCID50·mL-1。应用建立的PCR方法能够从发病的临床样品中检测出IBRV且比病毒分离方法更为敏感,操作简便。结果表明建立的PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于IBRV的临床检测。; 王嵩林红丽王宇鹏刘振格王杰杨明发余丽芸侯喜林; 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒聚合酶链反应

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的干酪乳杆菌免疫保护效力被引量：10: 2014年; 利用干酪乳杆菌作为传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2抗原传递系统,探讨口服雏鸡的免疫次数、免疫剂量、免疫途径和攻毒保护效果。用pLA-VP2重组干酪乳杆菌对5日龄雏鸡进行二次和三次免疫,并设108、109、1010 CFU/mL的重组干酪乳杆菌组,间接ELISA检测血清IgG和小肠洗液sIgA,末免后7 d攻毒,计算保护效果。根据确定的2次免疫和109 CFU/mL免疫剂量免疫5日龄雏鸡,分别口服、滴鼻/点眼pLA-VP2/L.casei,口服、肌注商品活苗及口服pLA/L.casei和PBS为对照,监测IgG和sIgA抗体水平;末免后7 d检测脾淋巴细胞增殖情况并攻毒,7 d后剖检,观察法氏囊损伤程度并记录病变得分和保护率。结果表明各组的特异性sIgA、IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.01);口服pLA-VP2/L.casei组的淋巴细胞刺激指数显著高于其他组(P<0.01),保护率高达83.3%,免疫保护效果优于滴鼻/点眼组。因此,构建的重组干酪乳杆菌的安全性优于商品活苗,可以作为IBDV候选疫苗。; 林红丽侯申达王嵩王宇鹏栾云艳侯喜林; 关键词：VP2蛋白免疫次数免疫剂量免疫途径

截短NDVF蛋白的原核表达被引量：1: 2013年; 根据NDV LaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT-PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a(+)原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导入BL21(ED3)感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS-PAGE和Westem-blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31.1 kDa和27.9 kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Western blot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pETF780和pET-F760,并获得了高效表达,通过Western blot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。; 王杰王宇鹏刘振格杨鸣发林红丽田斌侯喜林; 关键词：新城疫病毒 F蛋白

重组乳杆菌质粒拷贝数测定方法的建立被引量：3: 2015年; 为建立一种快速、准确、特异的重组乳杆菌表达质粒拷贝数的定量检测方法,根据SYBR Green I荧光定量分析原理,对重组乳杆菌质粒拷贝数进行分析。借助计算机软件Oligo5对乳杆菌基因组和重组质粒DNA进行分析,设计特异性良好的引物,建立绝对定量的QPCR检测方法。利用该方法对3株重组乳杆菌质粒拷贝数进行测定。试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地确定重组乳杆菌质粒拷贝数,为进一步研究发酵过程中质粒拷贝数和表达水平相关性提供可靠基础。; 王宇鹏齐浩林红丽王嵩侯喜林; 关键词：乳杆菌 PLA 实时荧光定量PCR

牛冠状病毒DQ株感染BALB/c小鼠的敏感性研究被引量：5: 2014年; 为研究牛冠状病毒DQ株（BCoV-DQ）对BALB／c小鼠的敏感性，本研究将该病毒以不同剂量、不同途径感染小鼠，观察比较临床表现、体重变化、剖检及组织病理学变化。分别以100TCID50-700TCID50感染小鼠，结果显示300TCID50病毒可使试验小鼠出现明显的临诊症状和可见的病理变化。采用滴鼻、灌胃、腹腔注射三种途径感染小鼠，结果显示灌胃组个体变化差异大，组织器官病变明显，为最佳感染途径。取主要病变部位组织进行病毒基因组的RT—PCR扩增，证实该病毒可以在小鼠肠道内成功增殖。本实验表明BALB／c小鼠可以作为BCoV．DQ研究的替代动物。; 刘振格侯喜林余丽芸王宇鹏王杰田斌; 关键词：牛冠状病毒 BALB C小鼠敏感性

BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用被引量：9: 2014年; 为建立一种快速诊断牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),牛副流感病毒3型(BPIV-3)病毒病的方法,根据Genbank中登录的BRSV核衣壳蛋白N基因序列和BPIV-3的核衣壳蛋白N基因序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计2对特异引物,经过条件优化,建立了BRSV和BPIV-3的双重PCR检测方法。采用该方法检测BRSV和BPIV-3参考毒株,特异性良好。对参考毒株进行梯度稀释检测,结果该方法检测BRSV的敏感性可达10 TCID50·100μL-1,BPIV-3可达10 TCID50·100μL-1。应用建立的双重PCR方法能够从临床样品中检测出BRSV和BPIV-3。表明建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于BRSV和BPIV-3的临床检测。; 王嵩林红丽王宇鹏刘振格王杰杨明发余丽芸侯喜林; 关键词：牛呼吸道合胞体病毒

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白被引量：3: 2014年; 旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。; 林红丽王嵩王宇鹏栾云艳余丽芸侯喜林; 关键词：干酪乳杆菌 IBDV 蛋白质表达

qPCR方法检测不同条件下重组乳杆菌的pLA质粒拷贝数: 乳酸菌属于益生菌的一种，由于其益生作用明显，口服方便，所以近些年来乳酸菌作为口服疫苗的研究日益增多。作为一种新构建成功的乳杆菌质粒表达系统，表达量是其能否进行下一步研究的基础。为建立一种快速、准确、特异的重组乳杆菌表达质...; 王宇鹏; 关键词：乳杆菌实时荧光定量PCR 质粒拷贝数; 文献传递

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王宇鹏