杨怡
- 作品数：60 被引量：67H指数：5
- 供职机构：浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划浙江省重大科技专项基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学环境科学与工程更多>>
- 检测猪弓形虫ROP14抗体间接ELISA方法的建立被引量：2
- 2020年
- 为丰富和完善弓形虫病的检测方法,本试验基于弓形虫棒状体蛋白14(TgROP14)建立了间接ELISA检测方法。构建原核表达载体pET30α-ROP14,转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达并纯化获得TgROP14重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot试验验证其纯度及免疫原性。利用纯化透析后复性的rTg-ROP14建立猪弓形虫病间接ELISA检测方法,并对反应中各项条件进行了优化。结果表明最佳检测条件为:抗原包被量2μg/孔,血清稀释倍数为1∶20,封闭剂为5%脱脂奶粉,血清作用时间为60 min,二抗稀释倍数为1∶1 000,二抗作用时间为60 min,TMB作用时间为20 min,临界值为0.728。该方法敏感性为1∶80,批内批间重复试验变异系数均小于10%,重复性较好;使用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征(美洲型)阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清、猪A型口蹄疫阳性血清和猪瘟阳性血清均未见交叉反应,特异性较好。利用该方法对来自浙江省各个地区的436份猪血清样品进行检测,同时使用商品化的间接血凝试剂盒进行验证,符合率为72.7%(317/436)。综上所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于临床样品的检测,为猪弓形虫病的血清流行病学调查提供了依据。
- 黄冶川阳毅敏潘灵韬庄浩瀚陈学秋杨怡杜爱芳
- 关键词：弓形虫间接ELISA
- 一种用于检测弓首蛔虫感染的miRNA标志物、引物、试剂盒及应用
- 本发明提供了一种用于检测弓首蛔虫感染的miRNA标志物、引物、试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。本发明基于弓首蛔虫肝‑肺移行过程中释放至宿主血液中的循环外泌体miRNA，设计实时荧光定量PCR扩增引物，通过同时检测血...
- 马光旭杨一帆陈学秋陈宜杨怡杜爱芳
- 基于枯草芽孢杆菌表面展示的重组益生菌抗捻转血矛线虫感染研究
- 益生菌能够有效控制病原体感染。捻转血矛线虫耐药性问题日趋严重,益生菌作为新型生物制剂,调节宿主免疫反应并保护其免受感染的研究鲜有报道。本研究首先对捻转血矛线虫感染湖羊皱胃微生物菌群进行16S rRNA测序并分析差异,进而...
- 杨怡张贵恒马光旭阳毅敏陈学秋杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫枯草芽孢杆菌益生菌制剂
- 捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定被引量：2
- 2017年
- 【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L^(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L^(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1) MgCl_2,60μmol·L^(-1)CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L^(-1)的反应体系(50 mmol·L^(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L^(-1)MgCl_2,60μmol·L^(-1) CoA,10μmol·L^(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.
- 郑秀平丁豪杰郭筱璐杨怡黄艳陈学秋周前进杜爱芳
- 关键词：捻转血矛线虫原核表达酶活测定
- 不同益生菌对南方夏季泌乳中后期奶牛生产性能的影响被引量：8
- 2016年
- 本文旨在研究不同益生菌对南方夏季泌乳中后期奶牛瘤胃发酵参数、营养物质表观消化率、血液生化指标及生产性能的影响。选用72头产奶量、泌乳天数、胎次均相近的泌乳中后期奶牛进行饲养对比试验,即对照组(添加酵母培养物100 g/d)和试验组(添加由酵母和芽孢杆菌组成的复合益生菌20 g/d)。试验期45 d,其中预饲期7 d。结果表明:与对照组相比,试验组瘤胃液中NH3-N和微生物蛋白(MCP)含量显著升高(P<0.05);有机物(OM)、粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)消化率显著提高(P<0.05);但对血液生化指标无显著影响;在牛舍温度(30.5±3.51)℃条件下,试验组能保持泌乳中后期奶牛产奶量的相对稳定,显著降低乳中尿素氮(MUN)含量(P<0.05),并且乳蛋白总量趋于增加;此外,试验组每天每头可获益3.36元。在南方夏季的泌乳中后期奶牛日粮中添加由酵母和芽孢杆菌组成的复合益生菌可改善奶牛瘤胃发酵环境,提高营养物质消化率及奶牛生产性能,增加养殖效益。
- 夏天婵罗学明常誉张勇杨怡叶均安
- 关键词：益生菌奶牛营养物质消化率
- 华支睾吸虫间接ELISA检测方法的建立及初步应用被引量：3
- 2015年
- RT-PCR扩增华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的Enolase基因后,进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物;以纯化后的蛋白为包被抗原建立ELISA方法,并对工作条件进行优化。结果表明,ELISA最佳工作条件为:抗原最佳包被质量浓度为5mg/L,37℃1h再4℃过夜;5%脱脂奶粉,37℃封闭1h;待检血清1∶100稀释37℃孵育1h;酶标二抗1∶5 000稀释,37℃孵育45min;TMB显色作用时间10min;确定的阴阳性血清临界值为0.253。所建立的ELISA方法特异性较好,可检测犬华支睾吸虫病阳性血清,与犬卫氏并殖吸虫病阳性血清、犬蛔虫病阳性血清、犬弓形虫病阳性血清、犬新孢子虫病阳性血清均不发生反应。该方法敏感性为1∶3 200。批间批内重复性试验变异系数均小于10%。在临床应用中,对浙江地区353多份犬血清的检测表明,样品阳性率为1.13%。本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学快速检测,为华支睾吸虫的血清流行病学调查提供了有效手段。
- 潘辰杨怡陈学秋杜爱芳
- 关键词：华支睾吸虫间接ELISA
- 弓形虫多表位PLGA纳米疫苗的研究
- 2024年
- 构建弓形虫多表位PLGA纳米疫苗并评估其可行性,预测弓形虫TgMIC3蛋白的B、T淋巴细胞优势抗原表位,联合抗原表位SAG1((238-256))、GRA7((20-28))和AS15,构建出新型多表位肽,用生物信息学工具对其理化性质、三级结构和分子对接能力等特征进行分析;原核表达并纯化多表位重组蛋白(multi-epitope protein, MEP),通过Western blot鉴定纯化效果;搭建MEP-PLGA纳米递送体系,对纳米颗粒进行表征。结果表明,多表位肽为亲水性蛋白非过敏原,具有一定抗原性,抗原表位均呈现在蛋白表面,能与MHC分子H-2-Dd稳定结合;可在BL21(DE3)大肠埃希氏菌表达系统中稳定表达,并能被特异性抗体所识别;构建的MEP-PLGA纳米递送体系包封为54.42%,纳米颗粒饱满,大小均一。成功设计并构建出弓形虫多表位PLGA纳米疫苗,为弓形虫新型纳米疫苗的研发奠定了基础。
- 张飞跃伍孟琛吴海燕马光旭吴飞杜爱芳杨怡
- 关键词：弓形虫
- 抗桔青霉毒素单链抗体及其制备方法与应用
- 本发明提供一种抗桔青霉毒素的单链抗体。本发明采用人工偶联抗原桔青霉毒素—BSA/BSA和桔青霉毒素—OVA/OVA抗原组合对抗体-核糖体-mRNA三联体复合体进行亲和筛选，采用原位RT-PCR方法对亲和筛选产物进行回收，...
- 杜爱芳程海卫王素华赵现锋杨怡陈学秋陈一飞
- 文献传递
- 桔青霉毒素-蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法
- 本发明提供一种桔青霉毒素--蛋白载体人工偶联抗原的碳二亚胺合成法，采用水溶性1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为偶联剂。桔青霉毒素先进行活化，而后与偶联试剂相互反应，...
- 杜爱芳程海卫杨怡陈学秋
- 文献传递
- 弓形虫环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基调控弓形虫的增殖及毒力
- (目的 )弓形虫是一种可以感染几乎所有温血动物的寄生性原虫,cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)是在弓形虫无性生殖阶段表达并具有重要功能的蛋白质,催化亚基(PKAC)作为该蛋白的核心部分,参与多种细胞信号转导通路,为探索其在...
- 孙洪超杨怡杜爱芳
- 关键词：弓形虫自噬毒力亚细胞定位
