吴海东
- 作品数：10 被引量：36H指数：4
- 供职机构：天津医科大学更多>>
- 发文基金：天津市自然科学基金国家自然科学基金天津市科技发展战略研究计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用被引量：7
- 2010年
- 目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白TPT1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-TPT1,转化大肠杆菌BL21(DE3),TPT1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的TPT1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗TPT1抗血清。结论:成功构建原核表达质粒pRSETA2-TPT1,表达并纯化TPT1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究TPT1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础。
- 赵一璠李海芳汤石明王萌吴海东刘民李欣汤华
- 关键词：原核表达纯化抗体肿瘤
- miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用
- 本发明公开了miRNA-10a在制备抑制结肠癌的侵袭和转移药物中的应用，所述miRNA-10a是序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。通过实验表明：与低转移性细胞株SW480相比，miRNA-10a在高转移性细...
- 汤华李欣吴海东刘涛万海英李怡璇王芳刘民
- 文献传递
- RNA干扰敲减PIWIL1表达对人结肠癌细胞SW620增殖,粘附及侵袭能力影响被引量：1
- 2010年
- PIWIL1为AGO蛋白(Argonaute proteins)PIWI亚家族的成员之一,在睾丸中特异表达.其在干细胞自我更新、RNA干扰和翻译调节中起着重要的作用.本文采用实时PCR方法检测PIWI基因家族中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4在人结肠癌SW620细胞中mRNA表达水平,首次证实了在SW620细胞中,PIWIL1相对PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4,其表达水平最高(P(0.05).构建表达针对PIWIL1的小发卡结构干扰RNA的重组质粒,并用Western印迹验证其达到较高的干扰效率.用脂质体将重组质粒转染入SW620细胞中,通过MTT实验、集落形成实验、细胞聚集实验及细胞侵袭转移实验,分别观察到其可抑制SW620细胞的生长、增殖、侵袭转移能力,增强了SW620细胞的粘附能力.提示PIWIL1可能在结肠癌发生、发展过程中发挥作用.
- 任超逸吴海东浦永汤石明李欣刘民汤华
- 关键词：结肠癌SW620细胞RNA干扰
- MicroRNA在六种不同器官肿瘤细胞系中的差异表达被引量：10
- 2007年
- [目的]利用生物芯片技术分析microRNA(miRNA)在六种不同器官肿瘤细胞系中mi-croRNA(miRNA)的表达差异。[方法]将210个(206个miRNA,4个阳性对照)与已知人类和小鼠miRNA互补的序列作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片。提取肿瘤细胞(HeLa、MCF-7、A549、HT-29、ES-2、K562)的miRNA,用荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交。用Sca-nArrayTMExpress1.0扫描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果。并用Northernblot和RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证。[结果]芯片检测到在六种不同器官肿瘤细胞系中,发现115种miRNA存在差异,91种miRNA没有明显差异。其中,miR-21在六种肿瘤细胞表达水平均较高,miR-125b表达水平均较低,let-7在六种细胞系中表达水平较低。miR-17-5p和miR-20a呈集簇表达,在卵巢肿瘤ES-2细胞系中的表达水平高于其它细胞,乳腺肿瘤细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa的miRNA的表达谱聚为一类。[结论]应用生物芯片技术检测细胞中miRNA的表达差异谱是可行的,miRNA可能参与肿瘤的发生发展。
- 马卓娅汤华李欣刘民吴海东王晶
- 关键词：寡核苷酸芯片MICRORNA肿瘤表达谱
- MicroRNA在6种肿瘤细胞中的表达差异被引量：10
- 2007年
- 目的:利用生物芯片技术分析6种不同器官肿瘤细胞中microRNA(miRNA)的表达差异。方法:将210个与已知人类和小鼠miRNA互补的序列(206个miRNA,4个阳性对照)作为探针,点于玻片上制备寡核苷酸芯片。提取肿瘤细胞HeLa(人宫颈癌上皮细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、ES-2(人卵巢透明细胞癌)、K562(人慢性髓细胞性白血病细胞)的miRNA,荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交;用ScanArrayTM Express1.0扫描仪扫描荧光信号,采用ScanArray3.0和Cluster3.0软件分析处理扫描结果;Northern blotting和RT-PCR方法对芯片检测结果进行验证。结果:在6种不同器官肿瘤细胞中,检测到115种miRNA存在差异,91种miRNA没有明显差异;其中,miR-21在6种肿瘤细胞表达水平均较高,miR-125b表达水平均较低,let-7不同亚型在6种细胞系中表达水平较低;miR-17-5p和miR-20a呈集簇表达,在卵巢肿瘤ES-2细胞中的表达水平高于其他细胞,乳腺肿瘤细胞系MCF-7和宫颈癌细胞系HeLa的miRNA表达谱聚为一类。Northern blotting检测到miR-17-5p及其前体在K562细胞中均见表达,A549和ES-2细胞中只见较弱的前体表达,MCF-7、HeLa和HT-29中可见明显的前体和较弱的成熟miRNA的表达。RT-PCR检测到miR-17-5p前体在K562细胞中表达水平高于其他几种细胞,在ES-2细胞中的表达量低于K562细胞,同时高于另外4种细胞;miR-21在6种肿瘤细胞中表达水平均较高,在A549细胞中表达最高。结论:应用生物芯片技术检测肿瘤细胞中miRNA的表达差异为进一步探索miRNA与肿瘤间的关系奠定基础。
- 马卓娅汤华李欣刘民吴海东王晶
- 关键词：MICRORNA肿瘤细胞寡核苷酸芯片
- 喉癌发生相关特异基因筛选与验证被引量：4
- 2007年
- 为了检测喉鳞状细胞癌相关的基因表达变化特征,筛选与喉癌发生相关的特异基因.从3名患者体内分别取正常喉上皮组织和喉鳞状细胞癌组织.应用基因芯片技术进行基因表达差异分析及系统聚类分析,并进行半定量RT-PCR验证部分基因芯片结果.本实验基因芯片包括7267条探针,其中,在3对样本中,表达发生显著差异的基因共有94条,有31条上调,63条下调,并且系统聚类分析将正常和癌组织各分为一类,半定量RT-PCR结果与芯片结果一致.实验表明,细胞的代谢、生长、信号传递相关基因(如RAN、PDCD10、zyxin、TACSTD1等)参与了喉癌的发生、发展,并可能扮演了重要角色.
- 吴海东汤华王晶刘民李欣
- 关键词：喉癌基因芯片表达谱
- 纤维连接蛋白1的原核表达、纯化及抗体的制备
- 2010年
- 目的构建人纤维连接蛋白1（FN1）基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性抗体。方法利用RT—PCR方法扩增人FN1编码序列450bp的片段，包含FN1羧基端的150个氨基酸。构建原核表达质粒pRSETA2-FN1，转化大肠杆菌BL21（DE3），FN1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过Ni^2＋-NTA树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组化检测其特异性。结果成功构建重组质粒pRSETA2-FN1，限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序均显示插入片段正确。SDS—PAGE凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为20000（FN1-His标签），与预期结果一致。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价约为1：10000，Western blot显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系HepG2全细胞裂解液中相对分子质量约250000的纤维连接蛋白。免疫组织化学可显示FN1在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。结论成功地原核表达了FN1C-末端蛋白，并免疫获得了抗FN1特异性抗体。
- 王菲菲苏畅吴海东王萌孔鹏洲刘民李欣汤华
- 关键词：纤维连接蛋白基因表达抗体癌症
- 人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用被引量：4
- 2010年
- 目的:表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45(DNA fragmentation factor 45,DFF45)融合蛋白并制备多克隆抗体。方法:构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activatedSepharoseTM4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果:成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1∶20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论:DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。
- 孔卫青李海芳刘涛吴海东强冉汤石明刘民汤华
- 关键词：DFF45融合蛋白多克隆抗体
- 人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用
- 2008年
- 目的:原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRsetA2-HMGB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),HMGB1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:成功构建原核表达质粒,表达并纯化HMGB1蛋白。ELISA检测抗体效价为1∶16000以上,Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论:HMGB1蛋白和抗体的成功制备,为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。
- 田爽刘民李欣浦永吴海东汤华
- 关键词：HMGB1原核表达抗体癌症
- MicroRNA在喉癌中的差异表达及其功能研究
- 目的：运用基因芯片技术筛选喉鳞状细胞癌中miRNA表达变化及其作用机制。 方法：利用基因芯片技术筛选喉鳞状细胞癌组织与癌旁正常喉上皮组织miRNA和mRNA表达水平的差异,同时对mRNA表达谱进行了聚类分析,并运用半定量...
- 吴海东
- 关键词：MICRORNA喉癌表达谱MIR-21
- 文献传递
