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刘德松: 作品数：10 被引量：24H指数：3; 供职机构：四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室更多>>; 发文基金：国家自然科学基金四川省学术和技术带头人培养资金国家教育部博士点基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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PER1与RACK1蛋白作用位点分析被引量：3: 2007年; 目的筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域。方法采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用。结果酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1(WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用。结论RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于、、三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位。; 鲁芳胡丽娟刘德松汪宇辉刘彦友甘露薛建新万朝敏王正荣; 关键词：近日节律蛋白相互作用 RACK1 酵母双杂交

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达被引量：6: 2006年; 目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。; 张雷陈建平张莉王涛刘德松田玉; 关键词：嗜肺军团菌克隆

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达: 2006年; 目的构建霍乱毒素A亚基基因(ctxA)的融合表达载体,并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基(CTA)免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板,PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-CTA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET-ctxA,经SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。; 张莉陈建平张雷王涛刘德松田玉; 关键词：霍乱弧菌克隆基因表达

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达被引量：2: 2007年; 目的构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip。经限制性核酸内切酶Hind和BamH酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcD-NA3.1-ip的瞬时和稳定表达。结果成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒。在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白。结论本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。; 杨志伟陈建平刘明杰张雷刘德松; 关键词：嗜肺军团菌转染体外表达

霍乱弧菌ctxAB融合基因的克隆及原核表达被引量：1: 2006年; 目的构建霍乱毒素A亚基基因(ctxA)和B亚基基因(ctxB)的融合表达载体,并在原核系统表达,为霍乱毒素(CT)免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板,利用重叠PCR技术,扩增出含有ctxA和ctxB的融合基因片段ctxAB,并与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达TrxBB-CTAB融合蛋白,用SDS-PAGE及W estern b lot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了霍乱弧菌1 158bp的ctxAB融合基因,成功构建了重组质粒pET-ctxAB,SDS-PAGE及W estern b lot分析显示重组质粒pET-ctxAB在原核系统中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因和ctxB基因通过重叠PCR成功地融合在一起,融合基因ctxAB在大肠杆菌中得到了高效表达。; 张雷张莉陈建平王涛刘德松田玉; 关键词：霍乱弧菌重叠PCR 克隆基因表达

信号标签诱变突变体文库穿梭质粒构建被引量：1: 2006年; 目的建立信号标签诱变突变体穿梭质粒,为构建信号标签诱变突变体文库及病原微生物毒力基因筛选打下基础。方法通过PCR扩增信号标签(signature tags,STs)片段,导入载体pC6,构建重组质粒pC6RS,转化到大肠杆菌CC118中,提取重组质粒后转化到大肠杆菌S17-1中。结果经过PCR、核苷酸序列测定鉴定,成功地构建了pC6RS质粒。; 刘德松王涛陈建平鲁芳张雷杨志伟; 关键词：穿梭质粒病原微生物毒力基因

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究被引量：4: 2007年; 目的构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1--pilE。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物。将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性。结果扩增出了429bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白。pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1(+)组(P<0.01)。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。; 杨志伟陈建平王涛田玉刘德松; 关键词：嗜肺军团菌免疫原性体外表达

hPeriod1_(PAS)结构域相互作用蛋白的筛选和研究被引量：9: 2006年; 目的寻找与近日节律系统核心基因Period1(Per1)相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT-PCR检测RACK1(receptors for activated C-k inase)表达的组织特异性及节律性;运用RNA i技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。; 鲁芳胡丽娟汪宇辉刘德松刘彦友冀治鸿万朝敏王正荣; 关键词：时间生物学近日节律相互作用蛋白酵母双杂交

酵母双杂交筛选血液中与PERIOD1相互作用的新蛋白被引量：3: 2006年; 采用酵母双杂交方法,以人PER1的PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选能与之相互作用的蛋白.经酶切和核苷酸序列测定,证实重组诱饵载体hper1PAS/pGBKT7构建成功.血cDNA文库转化效率为1.4×106/3μg pGADT7-Rec.酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.; 胡丽娟鲁芳汪宇辉刘德松刘彦友肖静朱彬郭慧玲万朝敏王正荣; 关键词：蛋白相互作用酵母双杂交

嗜肺军团菌血清10型信号标签诱变突变体文库构建: 目的：本文通过PCR扩增特异信号标签，导入载体质粒pC6，构建信号标签诱变突变体文库穿梭质粒pC6RS;通过细菌结合配对时转座子的转座作用，使特异信号标签随机插入到嗜肺军团菌的基因组中，由此构建嗜肺军团菌血清10型信号标...; 刘德松; 关键词：嗜肺军团菌血清诱变突变体库; 文献传递

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