金华君
- 作品数：26 被引量：52H指数：4
- 供职机构：第二军医大学东方肝胆外科医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家杰出青年科学基金上海市卫生局科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 多靶向VEGF-EGFR的Fc融合蛋白EVP1的构建及其结合特性被引量：4
- 2012年
- 目的:构建能同时靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的Fc融合蛋白EVP1,并分析其多靶向结合功能,为后续的抗肿瘤研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增Herin基因和Flt-1基因Ig样第二结构域(Flt-1D2)编码序列,全序列合成带有点突变的人IgG1的Fc段编码序列,利用重组PCR方法将Herin、Flt-1D2和Fc基因依次连接,构成Herin-Flt-1D2-Fc基因(命名为EVP1基因)。再将EVP1编码基因插入质粒pDC659,构建携带EVP1基因的腺病毒穿梭质粒pDC659-EVP1。将质粒pDC659-EVP1与腺病毒骨架载体pPE3-F35共转染至293细胞,包装获得表达EVP1融合蛋白的非增殖型腺病毒Ad5/35-EVP1,经PCR鉴定,扩增、纯化病毒,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用MOI=11的腺病毒Ad5/35-EVP1感染293细胞,4 d后收集细胞培养上清液。采用硫酸铵盐析法和Protein G亲和层析对融合蛋白EVP1进行纯化。Western blotting检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的含量。采用间接免疫荧光实验和Octet Red 96生物分子相互作用分析仪对融合蛋白EVP1的靶向结合特性进行定性和定量检测。结果:成功包装出腺病毒Ad5/35-EVP1,滴度为5.4×109PFU/ml。腺病毒Ad5/35-EVP1-293细胞系统能有效表达融合蛋白EVP1;MOI=11时,融合蛋白EVP1的表达量为(1 613.94±24.65)ng/ml。蛋白EVP1与高表达EGFR的A431细胞和高表达HER2的人卵巢癌SK-OV-3细胞有良好的结合能力,与抗原EGFR、HER2、VEGF结合的亲和力常数Kd分别为4.55、18.70和0.63 nmol/L。结论:成功制备多靶向融合蛋白EVP1,它能高效结合VEGF、EGFR受体家族成员,具有良好的抗肿瘤临床应用价值。
- 左明辉金华君黎江易中梅叶真龙钱其军
- 关键词：靶向治疗融合蛋白表皮生长因子受体FC段
- 一种T细胞高活性的启动子及其用途
- 本发明属于分子生物学领域，涉及一种T细胞高活性的启动子及其用途。具体地，所述T细胞高活性的启动子包含元件1和元件2，其中，所述元件1为EF1α启动子和/或含内含子的EF1α启动子；所述元件2为选自mCMV增强子、hCMV...
- 钱其军金华君吕赛群刘品一李振海李林芳黎江吴红平吴孟超
- 表达SIRPα-Fc的基因-溶瘤腺病毒对胆管癌治疗作用的实验研究
- 2015年
- 目的:研究表达SIRPα-Fc融合基因的基因-溶瘤腺病毒SG655-SF对胆管癌的治疗作用。方法:将信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)突变体CV1与人Ig G1 Fc段融合(简称SF),构建SF编码序列(基因)。将SF基因插入条件增殖型腺病毒载体SG655,构建基因-溶瘤腺病毒SG655-SF。重组病毒经鉴定正确后,经扩增、滴度测定,感染293细胞。Western blot检测外源基因的表达情况。间接免疫荧光检测293细胞表达的SF蛋白对胆管癌细胞的结合能力。噻唑蓝(MTT)法测定病毒对胆管癌细胞的杀伤作用。建立人类胆管细胞癌裸鼠移植瘤模型,用SG655-SF治疗,观察疗效。取肿瘤组织进行切片检查,验证其抗肿瘤作用。结果:成功构建SF表达框、基因-溶瘤腺病毒SG655-SF。SG655-SF感染293细胞后,能高效表达SF蛋白。293细胞表达的SF蛋白能有效结合CD47高量表达的胆管癌细胞株EH-CA1-T、EHCA1-Y。SG655-SF能有效杀伤胆管癌细胞。SG655-SF可以有效抑制肿瘤在裸鼠体内生长。肿瘤组织切片检查提示有肿瘤坏死和病毒浸润。结论:基因-溶瘤腺病毒SG655-SF具有良好的抗胆管癌活性。
- 巩睿智吕赛群马宜冬左明辉叶真龙朱海莉吴红平施军霞李林芳金华君钱其军
- 关键词：胆管癌溶瘤腺病毒CD47
- 恶性肿瘤患者DC-CTL/CIK免疫治疗后的免疫和临床响应研究
- 目的：近几年来，免疫治疗已经被应用于临床治疗多种恶性肿瘤，然而，对于患者接受DC-CIL/CIK治疗后的免疫和临床响应进行大规模的数据分析，这方面的研究仍非常少。本文从个体分析和系统分析两个水平上，分别对DC-CIL/C...
- 王颖徐增辉周福孙艳程静波李林芳金华君钱其军
- 关键词：免疫指标TREG
- 腺病毒介导的T细胞高效基因表达系统的构建
- 2015年
- 结合转基因修饰的手段,能有效提高细胞免疫治疗的疗效,但由于缺乏T细胞高活性表达系统,限制了该方法的应用。构建腺病毒介导的双荧光素酶启动子活性筛选系统,检测一系列常用强启动子(CMV、CMV(in)、CAG、EF1α及CASI)在T细胞株K562及Jurkat中的活性,发现EF1α启动子活性在T细胞株中的活性最高。在EF1α的基础上,增加mCMV增强子和hCMV增强子顺式作用元件,构成了2个新型嵌合型启动子CCEF及CCEF(in)。双荧光素酶检测系统检测结果表明,新构建的2个启动子在T细胞中的活性高于EF1α,且两者相比CCEF启动子活性更高(p<0.05)。利用CCEF启动子控制PD-1全长抗体基因,并将此表达框插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒Ad-CCEF-anti-PD-1。通过Western blotting及ELISA方法检测病毒感染T细胞株后,抗体基因的表达效率。结果表明,Ad-CCEF-anti-PD-1感染T细胞后,PD-1抗体能在T细胞中正确表达,且表达量较高(K562中11.019μg/mL,Jurkat中9.078μg/mL),表明该腺病毒介导的T细胞高效的基因表达系统成功构建,具有良好的应用前景。
- 刘品一吕赛群崔磊李振海黎江李林芳吴红平金华君钱其军
- 关键词：腺病毒启动子PD-1
- 腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用被引量：1
- 2015年
- 目的:构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统,并利用其筛选一种广谱高活性启动子。方法:将待检测启动子控制的萤火虫荧光素酶(Fluc)基因表达框插入腺病毒E1区,CMV启动子控制的海肾荧光素酶(Rluc)基因表达框插入E3区作为内参,构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统。检测不同病毒感染量条件下测得的启动子活性数据差异、组内差异,难转染细胞内的转染情况,分析该系统的操作简便性、稳定可靠性。应用该系统检测常用启动子CAG、CASI及新启动子CCAU在一系列细胞内的活性,从中筛选出一种广谱高活性启动子。结果:成功构建了腺病毒介导的双荧光素酶报告系统;不同MOI值下测得的各启动子相对活性值无显著差异(P>0.05);在所实验的细胞内均能有效且准确地测定各启动子的活性,且复孔间方差小;CCAU在所实验的9株细胞中的表达活性显著(P<0.05)或极显著地(P<0.01)高于CASI以及CAG的表达活性。结论:构建获得的腺病毒介导双荧光素酶报告系统操作简便、稳定可靠、通用性强,可作为启动子活性筛选的一种新方法;利用该系统筛选获得了一种新的广谱高活性启动子CCAU。
- 李振海吴红平徐增辉吕赛群施军霞刘品一李林芳金华君吴孟超钱其军
- 关键词：腺病毒启动子
- 应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒
- 2011年
- 目的建立应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的技术体系,并初步检测所制备病毒的感染活力。方法采用杆状病毒生产系统包装rAAV8-EGFP,经高效液相色谱法提取并纯化病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度,通过观察绿色荧光蛋白的表达强度来检测rAAV8-EGFP对HEK-293细胞的感染活力。结果实时荧光定量PCR显示成功制备高滴度rAAV8-EGFP,滴度可达1.5×1012vg/ml,100ml摇瓶共得到1.5×1013vg rAAV8-EGFP病毒颗粒;感染后的HEK-293细胞具有较强的绿色荧光蛋白表达。结论应用杆状病毒系统成功制备高滴度、高活力的重组腺相关病毒,为后续研究奠定了基础。
- 范丽徐增辉金华君徐凤青丁娜严淋钱其军
- 关键词：杆状病毒系统腺相关病毒昆虫细胞
- 晚期非小细胞肺癌患者DC-CIK治疗前的免疫状态与预后的关系被引量：9
- 2015年
- 目的探讨晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cellcytokine induced killers,DC-CIK)治疗前外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(regulatory T cells,TRegs)、CD3+CD56+细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIKs)、CD4+/CD8+T细胞比值与预后的关系。方法采用流式细胞仪技术检测45例晚期NSCLC患者DC-CIK治疗前、后外周血CD4+CD25+CD127-TRegs、CD3+CD56+CIKs、CD4+和CD8+T细胞,并与患者临床特征进行相关分析;采用Cox回归模型分析治疗前CD4+CD25+CD127-TRegs、CD3+CD56+CIKs、CD4+/CD8+T细胞比值对患者预后的影响。结果晚期NSCLC患者DC-CIK治疗前、后比较,治疗后患者外周血CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增多,CD4+/CD8+T细胞比值下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);原发病灶瘤体最长直径越大,患者治疗前外周血TRegs越多,CIKs越少(均P<0.05);生存分析显示,治疗前TRegs越多,患者预后越差,生存期越短,且TRegs>7×109/L影响患者的生存(P<0.05)。结论晚期NSCLC患者外周血TRegs是判断预后的独立预测指标。
- 蒋琦徐增辉王颖孙保木金华君钱其军
- 关键词：预后
- 肝细胞癌循环肿瘤细胞与肿瘤转移和预后关系的研究被引量：2
- 2015年
- 目的研究肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)与肿瘤转移和预后的关系。方法选取35例肝细胞癌患者,应用密度梯度离心法联合免疫磁珠阴性富集法富集CTC,然后利用染色体荧光原位杂交和细胞免疫荧光技术进行CTC鉴定并计数,同时记录临床相关特征,对数据进行统计学分析。结果所有患者均检出CTC,阳性率为100%,CTC个数均值为(4.1±2.5)个。对患者进行分组,Ⅰ组的CTC个数<5,Ⅱ组的CTC数量≥5。Ⅰ组、Ⅱ组的CTC数量差异有统计学意义(P=0.001),患者的性别、年龄与肿瘤转移无关(P=0.581、0.531),CTC的数量与转移及预后有关(P=0.024、0.01),Ⅰ组、Ⅱ组的转移和预后差异有统计学意义。结论 HCC患者外周血CTC的数量与肿瘤转移及预后有关,CTC的数量≥5时,可能肿瘤更具转移倾向,预后更差,患者生存期更短。
- 王真徐增辉郑罗凝王颖孙保木金华君钱其军
- 关键词：肝细胞癌循环肿瘤细胞预后
- 靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞被引量：10
- 2014年
- 目的探讨靶向黏蛋白1(mucin 1,MUC1)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞株(CAR-T)对MUC1高表达肝癌细胞的特异杀伤能力。方法分别构建第1代与第3代靶向MUC1的CAR基因表达框(MUC1-CAR与G3MUC1-CAR),并将其装入慢病毒载体,利用获得的重组慢病毒感染Jurkat细胞,通过CCK-8法、ELISA法、乳酸脱氢酶释放实验,分别检测在MUC1抗原存在条件下,CAR-T细胞的增殖、IL-2分泌量、杀伤作用。结果成功构建2种靶向MUC1嵌合抗原受体表达框的重组慢病毒Jurkat CAR-T细胞株。两种Jurkat CAR-T细胞均能特异识别MUC1分子,杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701,而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不杀伤;第3代CAR修饰的Jurkat T细胞接触MUC1分子后,其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均优于第1代MUC1修饰细胞(P<0.05或P<0.01)。结论靶向MUC1的Jurkat CAR-T细胞能特异杀伤MUC1高表达的肝癌细胞。
- 马宜冬王真巩睿智李林芳吴红平金华君钱其军
- 关键词：黏蛋白1JURKAT细胞
