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杨堃: 作品数：84 被引量：193H指数：8; 供职机构：青岛大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金山东省自然科学基金青岛市科技发展计划项目更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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靶向小鼠TNF-α基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定被引量：1: 2014年; 目的:构建靶向小鼠TNF-α基因的RNA干扰慢病毒载体,为RNA干扰基因治疗提供基础。方法:设计、合成3组靶向TNF-α基因的特异小干扰RNA(siRNA):siRNA1、siRNA2、siRNA3及阴性对照siRNA,体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用real-time PCR和ELISA法检测其对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的影响。筛选出特异且抑制性高的siRNA,根据其序列设计合成寡核苷酸链,构建表达短发卡RNA(shRNA)的重组慢病毒质粒并测序,经鉴定质粒与包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,计算病毒颗粒滴度。结果:①siRNA1、siRNA2、siRNA3组的TNF-αmRNA相对表达量分别为0.24±0.01、0.16±0.02、0.19±0.01,与阴性对照0.95±0.02相比差别均具有统计学意义(F=531.3,P<0.001);与阴性对照相比,mRNA表达抑制率分别为74.26%、83.09%、79.93%。siRNA1、siRNA2、siRNA3及阴性对照组的IL-1βmRNA或IL-6 mRNA相对表达量之间差别无统计学意义(F=0.981,P=0.980 7>0.05;F=0.739,P=0.586 7>0.05)。②siRNA1、siRNA2、siRNA3的TNF-α蛋白表达分别为(23.95±1.21)、(17.27±1.46)、(19.07±1.57)ng/ml与阴性对照的(35.37±2.93)ng/ml相比,差别均具有统计学意义(F=18.1,P=0.000 6<0.001);与阴性对照相比,TNF-α蛋白表达抑制率分别为32.29%、51.16%、46.08%。③以siRNA2序列设计、合成寡核苷酸链,构建重组慢病毒穿梭质粒,其PCR产物电泳结果为343 bp,空载体PCR产物306 bp;DNA测序显示pGCSIL-GFP-shRNA测序反应中断,但已显示部分插入序列。④转染后的293T细胞,生长良好,荧光表达强,慢病毒滴度为2×106TU/μl。结论:靶向小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒载体构建成功。; 赵颖杰王吉波辛苗苗梁宏达刘相萍杨堃隋爱华; 关键词：RNA干扰慢病毒载体巨噬细胞肿瘤坏死因子-Α

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达被引量：10: 2010年; 目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。; 马贵亮毛伟征杨堃安岗岱震波; 关键词：慢病毒感染脐血间质干细胞

靶向肿瘤坏死因子-α慢病毒介导RNA干扰的实验性治疗研究被引量：1: 2015年; 目的：观察靶向小鼠TNF-α RNA干扰（RNAi）慢病毒载体颗粒对小鼠巨噬细胞株RAW264.7表达TNF-α、IL-1β及IL-6的影响，及对胶原诱导性关节炎（CIA）的治疗作用。方法分别用靶向小鼠TNF-α RNAi慢病毒颗粒、慢病毒阴性对照、空白对照感染小鼠巨噬细胞株 RAW264.7，检测TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及TNF-α蛋白水平。制作小鼠CIA模型，设慢病毒RNAi治疗组、慢病毒阴性对照、空白对照和阳性对照，分别尾静脉注射 RNAi慢病毒颗粒、慢病毒阴性对照、PBS溶液，腹腔注射甲氨蝶呤，观测CIA关节炎积分，检测小鼠TNF-α血清水平，病理检查受累关节组织。结果①慢病毒治疗组TNF-αmRNA表达水平为0.291±0.021，低于慢病毒阴性对照0.925±0.013，差异有统计学意义（t=25.4，P〈0.01），抑制率为68.5%；②慢病毒治疗组TNF-α血清水平为（249±11） ng/ml，低于阴性对照（382±6） ng/ml，差异有统计学意义（t=10.31，P〈0.05），抑制率为34.7%。③慢病毒治疗组、阴性对照及空白对照之间，IL-1β、IL-6 mRNA表达水平差异无统计学意义（t=1.00，1.22，P均〉0.05）。④尾静脉注射后第8天，慢病毒治疗组关节炎分值为2.50±0.19，低于空白对照3.63±0.18及阴性对照3.75±0.16，差异均具统计学意义（F=42.8，P〈0.01），慢病毒治疗组与阳性对照的关节炎分值缓慢下降，至少持续至尾静脉注射后2周。⑤慢病毒治疗组、阳性对照TNF-α血清水平分别为（35±6） pg/ml、（32±7） pg/ml，均低于阴性对照47±3，差异有统计学意义（t=3.03，4.11，P均〈0.01）。病理显示慢病毒治疗组关节炎症细胞浸润减轻。结论靶向小鼠TNF-αRNAi在体外、体内有效抑制TNF-αmRNA及蛋白表达，降低CIA关节炎分值，减轻炎症细胞浸润。慢病毒介导RNAi为RA治疗提供一可行、有效方法。; 赵颖杰王吉波赵磊温大蔚潘琳杨堃隋爱华; 关键词：慢病毒肿瘤坏死因子-Α RNA干扰

一种检测Notch信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用: 本发明提供了一种检测细胞内Notch信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用，本发明所述检测试剂包括检测ADAM10基因、ADAM17基因、AES基因、CBL基因、CCND1基因、CD44基因等PCR反应引物以及相应的内参...; 王海波梁晔刘相萍王丽萍刘世海姚如永隋爱华杨堃迟静薇周泉刘加秀; 文献传递

IL-6对NIH3T3细胞MMP-3和TIMP-1表达影响被引量：1: 2010年; 目的探讨白细胞介素-6(IL-6)对小鼠NIH3T3成纤维细胞中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)表达的影响。方法应用不同浓度(0、5、10、15、20 mg/L)的IL-6刺激NIH3T3成纤维细胞,共同培育12 h收集细胞。应用Western blot和RT-PCR方法分别检测细胞内MMP-3和TIMP-1的表达。结果 MMP-3表达随着IL-6浓度的升高而上升,TIMP-1表达随着IL-6浓度的升高而下降。结论 IL-6能影响MMP-3和TIMP-1的表达平衡,可能是影响硬膜外瘢痕形成的机制之一。; 苏萌邹云雯褚言琛杨堃; 关键词：白细胞介素6 基质溶解素1 金属蛋白酶1组织抑制剂

内皮细胞微粒和血小板微粒在抗中性粒细胞胞质抗体相关性小血管炎患者中的表达被引量：1: 2020年; 本研究共纳入35例抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性血管炎(ANCA⁃associated vasculitis,AAV)患者,其中6例合并栓塞,同时纳入膜性肾病、慢性肾炎及健康对照组各25例,应用流式细胞术检测血浆内皮细胞微粒(endothelial microparticle,EMP)和血小板微粒(platelet microparticle,PMP)水平。结果发现AAV栓塞组EMP、PMP水平显著高于未栓塞组(均P<0.01),活动期AAV组EMP、PMP水平显著高于缓解期组、膜性肾病组、慢性肾炎组及健康对照组(均P<0.05),且缓解期AAV组EMP、PMP水平亦高于慢性肾炎组及健康对照组(均P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,EMP和PMP与伯明翰血管炎活动性评分、红细胞沉降率、C反应蛋白、D⁃二聚体均呈正相关(均P<0.05)。研究结果提示,EMP、PMP反映了免疫炎症介导的血管内皮损伤和血小板活化程度,可能与AAV疾病炎性反应和血栓形成有关。; 李婷邢广群张铭徐强杨堃; 关键词：血管炎内皮微粒血小板微粒

一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其PCR检测方法: 本发明提供了一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其PCR检测方法，本发明所述检测试剂包括检测BAX基因、ANGPTL4基因、IL1A基因、MYBL2基因、PEA15基因、PRKAA1基因、BIRC5基因、CASP1基因、DA...; 姚如永隋爱华刘世海杨堃刘相萍; 文献传递

2型糖尿病大鼠肾脏相关细胞因子表达与足细胞损伤关系: 2014年; 目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）、骨形态发生蛋白7（BMP-7）、结缔组织生长因子（CTGF）、nephrin在2型糖尿病肾病（DKD）大鼠肾脏组织表达变化，及其与肾脏足细胞损伤的关系。方法雄性SD大鼠50只，随机分为正常对照组（NC组，20只）和模型组（DKD组，30只），DKD组给予高糖高脂饲料喂养8周建立2型糖尿病模型，建模成功后空腹状态下给予小剂量链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）一次性腹腔注射；NC组给予常规饲料喂养，腹腔注射等量枸橼酸缓冲液，继续喂养8周。于8周末检测两组24 h尿清蛋白（UAL）、空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr），电镜观察肾小球足细胞超微结构的变化，光镜检测肾小球硬化指数（GSI），免疫组化、实时定量PCR检测肾组织nephrin、BMP-7、CTGF、TGF-β1的表达。结果与NC组比较，DKD组大鼠UAL、GSI明显升高，肾小球足细胞nephrin、BMP-7表达下调，而CTGF及TGF-β1表达上调，差异均有显著性（t=3.20-41.17,P〈0.01）。光镜下观察，DKD组大鼠肾小球肥大，系膜细胞增生，细胞外基质增多。电镜下观察，DKD组大鼠肾脏足细胞肿胀，足突融合消失，足细胞损伤。结论 DKD 大鼠肾小球存在足细胞损害，其机制可能与 BMP-7 表达下调及 CTGF、TGF-β1 过度表达有关。; 李臻王祥花杨堃马瑞霞; 关键词：转化生长因子Β 骨形态发生蛋白质类

原癌基因PIK3CA在宫颈癌组织中的表达及意义被引量：9: 2008年; 目的研究原癌基因PIK3CA在宫颈癌组织中的表达及其意义。方法用RT-PCR方法检测PIK3CA mRNA在15例正常宫颈组织和30例宫颈癌组织中的表达,免疫组化方法检测其蛋白在50例宫颈癌前病变组织及20例宫颈癌组织中的表达情况。结果从宫颈上皮内瘤样病变(CIN)到宫颈癌的发展过程中,PIK3CA的蛋白表达产物PI3K p110a蛋白表达水平逐渐增加(Hc=9.968,P<0.05);PIK3CA mRNA在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达差异有显著性(t=2.672,P<0.05)。结论PIK3CA基因改变与宫颈癌的发生发展有关,宫颈癌的发展过程伴随着PI3K p110a蛋白的表达异常。; 王洪艳崔竹梅刘湘萍隋爱华杨堃孙显路; 关键词：宫颈肿瘤宫颈上皮内瘤样病变

B细胞性非霍奇金淋巴瘤中CHFR mRNA的表达与其临床病理特征关系的研究被引量：2: 2013年; 目的:探讨CHFR(checkpoint with FHA and ring finger)基因在B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)中的表达水平及其与临床病理特征之间的关系。方法:采用荧光定量PCR方法检测81例B细胞非霍奇金淋巴瘤组织和38例淋巴结反应性增生组织(RH)CHFR mRNA的表达水平。结果:①81例B-NHL组织中低水平表达CHFR mRNA,其中2例表达缺失;而在淋巴结反应性增生组中该基因全部表达,差异有统计学意义(P<0.05)。②B-NHL患者中I+II期组和III+IV期组CHFR mRNA表达存在差异,III+IV期表达水平低于I+II期,差异有统计学意义(P<0.05);B-NHL组按IPI评分分0-1分组和2-5分组,高评分组CHFR mRNA表达量低于低评分组,差异具有统计学意义(P<0.05);而CHFR mRNA表达量与年龄、性别、有无症状、LDH水平及ECOG评分无相关性。结论:CHFR表达水平的降低在非霍奇金淋巴瘤的发生过程中具有一定作用,并与其恶性程度及进展相关。; 高艳华宋爱琴孙立荣叶俊丽赵艳霞邢晓明杨堃陈娟娟王红芳; 关键词：B细胞型非霍奇金淋巴瘤 CHFR基因实时荧光定量PCR

杨堃

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