李晓娟
- 作品数：11 被引量：33H指数：4
- 供职机构：黑龙江八一农垦大学更多>>
- 发文基金：博士科研启动基金黑龙江省科技计划项目黑龙江省教育厅科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 肝片吸虫重组GST、CatL蛋白及其DNA核酸联合免疫初步研究
- 肝片吸虫病是由肝片形吸虫(Fasciola hepatica)寄生于牛、羊等反刍动物肝脏胆管内引起的一种对动物危害十分严重的吸虫病。目前,该病主要依靠药物治疗,然而长期用药不仅可产生抗药性而且会造成环境污染,因此,疫苗研...
- 李晓娟
- 关键词：肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶组织蛋白酶L联合免疫
- 文献传递
- 肝片吸虫组织蛋白酶L基因的克隆、表达和免疫原性分析(英文)被引量：2
- 2009年
- 目的克隆和表达肝片吸虫组织蛋白酶L基因(FhCL),分析其免疫原性。方法根据GenBank公布的FhCL基因序列设计引物,以肝片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增FhCL基因编码序列,PCR产物经TA克隆,通过EcoRⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定获得重组质粒pMD18-T/FhCL,并将其亚克隆入原核表达载体pET30a(+),经PCR,以及BamHⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定,构建原核表达质粒pET30a(+)-FhCL,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白FhCL,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,以及蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白对感染肝片吸虫的山羊血清及免疫的SD大鼠血清的免疫反应性。结果PCR和BamHⅠ、HindⅢ双酶切均可见约1000bp的条带,测序结果显示重组质粒pET30a(+)-FhCL构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr42000(含6个组氨酸标签),与目的蛋白相符,以包涵体形式表达。Westernblotting分析结果显示,纯化的重组蛋白FhCL可被感染肝片吸虫的山羊血清和免疫的SD大鼠血清识别,在目的条带Mr42000处见单一特异性条带,而阴性对照血清则无反应带。结论克隆及表达了肝片吸虫组织蛋白酶L编码基因,重组蛋白具有良好的免疫原性。
- 李晓娟闻晓波冉旭华李树东王春仁朴范泽
- 关键词：肝片吸虫克隆原核表达
- 猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析被引量：5
- 2010年
- 为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。
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- 关键词：猪圆环病毒2型ORF2
- 绵羊肝片吸虫谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与序列分析
- 2012年
- 本研究扩增肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因,并进行同源性分析。根据GenBank发表的部分Fh GST基因序列设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出Fh GST基因完整的开放阅读框(openreading frame,ORF),测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析。获得Fh GST基因全长682bp,编码218个氨基酸,与澳大利亚分离的肝片吸虫GST同源性较高,与大片吸虫和卫氏并殖吸虫的GST也有较高的同源性。不同虫株GST基因具有较高的同源性,因此Fh GST蛋白不适合用作诊断抗原,但由于其存在交叉反应,GST基因作为分子疫苗的候选基因具有重要意义。肝片吸虫GST基因的克隆,为进一步研究GST蛋白的功能和作用奠定了基础。
- 冉旭华闻晓波王春仁刘娣刘娣孙中武李晓娟
- 关键词：肝片吸虫GST基因
- 肝片吸虫组织蛋白酶L真核表达载体构建及重组蛋白活性分析被引量：3
- 2013年
- 目的构建肝片吸虫组织蛋白酶L(CatL)的真核表达载体,研究重组蛋白的生物学活性。方法以构建好的重组质粒pET30a-FhCatL为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫组织蛋白酶L基因(catL),连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-CatL,转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况。结果重组质粒pEGFP-N1-CatL在HeLa细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应。结论肝片吸虫CatL真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有免疫反应性,可做为分子疫苗的候选和诊断抗原进行进一步的研究。
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- 关键词：肝片吸虫真核表达活性分析
- 肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆表达及活性分析被引量：5
- 2009年
- 目的克隆和表达肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(FhGST)以研究重组蛋白免疫学特性。方法参考Gen-Bank上发表的FhGST基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR法扩增FhGST基因,将扩增产物克隆入pET-30a(+),构建重组表达载体。经PCR、双酶切和序列测定鉴定后转入E.coliBL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对该重组蛋白进行分析和鉴定。结果成功获得肝片吸虫GST基因全长为657bp的编码序列,SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量为31.3kDa,以包涵体形式表达。Western blotting结果证实重组蛋白能被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能与感染肝片吸虫的绒山羊血清发生反应,表明重组蛋白具有免疫反应性。结论成功的克隆了肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因,实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,并具有良好的免疫学活性。
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- 关键词：肝片吸虫原核表达
- 肝片形吸虫重组组织蛋白酶L的免疫反应性和免疫原性分析被引量：4
- 2014年
- 目的分析肝片形吸虫(Fasciola hepatica)重组组织蛋白酶L(CatL)的免疫反应性,以及对SD大鼠的免疫原性。方法诱导含重组原核表达质粒pET30a-FhCatL的大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌表达,SDS-PAGE分析表达产物,以感染肝片形吸虫山羊血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性。20只SD大鼠随机均分为重组蛋白免疫组和佐剂对照组,免疫组大鼠皮下注射纯化的重组FhCatL,200μg/(只·次),共免疫3次,每次间隔3周;对照组用等量PBS与佐剂混合后注射。于第2次和末次免疫前,以及末次免疫后3、6和9周尾静脉采血,分离血清。利用间接ELISA法检测免疫大鼠血清IgG抗体水平,噻唑蓝比色法(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖情况。结果经纯化获得重组FhCatL蛋白,相对分子质量(Mr)约42 000。Western blotting分析结果表明,纯化重组蛋白能被感染肝片形吸虫的山羊血清识别。重组FhCatL蛋白免疫SD大鼠后可诱导产生特异性IgG抗体,随着免疫时间的延长抗体水平逐渐升高,于末次免疫后3周抗体效价达到峰值(1∶102 400),明显高于对照组(1∶1 000)。免疫组脾淋巴细胞刺激指数为2.176±0.047,显著高于对照组(1.171±0.032)(P<0.05)。结论重组FhCatL蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性。
- 冉旭华闻晓波王春仁李晓娟魏晓曼
- 关键词：肝片形吸虫组织蛋白酶L免疫原性免疫反应性
- 猪戊型肝炎病毒ORF2主要抗原表位区间接ELISA方法的初步建立被引量：4
- 2010年
- 应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓度ORF2-C为8μg/mL、ORF2-N为12μg/mL;血清最适稀释度均为1∶50,ORF2-C作用时间为50min、ORF2-N作用时间为90min;酶标抗体最适稀释度为1∶5000;ORF2-C判定标准:D450nm值≥0.348为阳性,D450nm值<0.348为阴性;ORF2-N判定标准:D450nm值≥0.397为阳性,D450nm值<0.397为阴性。与戊型肝炎病毒诊断试剂盒检测结果相比,阳性符合率分别为93.3%、86.7%。利用重组蛋白建立的ELISA方法特异性、敏感性和重复性均较好,且ORF2-C的检测效率明显高于ORF2-N,该方法的初步建立为进一步完善猪戊型肝炎病毒诊断方法奠定基础。
- 闻晓波王密冉旭华周恩民李晓娟侯喜林朴范泽
- 关键词：猪戊型肝炎病毒ORF2ELISA
- 肝片吸虫GST真核表达载体构建及重组蛋白活性分析被引量：3
- 2011年
- 目的构建肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶(GST)的真核表达载体,研究重组蛋白的免疫原性。方法以构建好的重组质粒pET30a-FhGST为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(GST),连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-GST,转染Hela细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况。结果重组质粒pEGFP-GST在Hela细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应。结论肝片吸虫GST真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有生物学活性,可做为分子疫苗的候选进行进一步的研究。
- 冉旭华闻晓波王春仁刘娣孙中武李晓娟王密
- 关键词：肝片吸虫GST基因真核表达活性分析
- 猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达被引量：4
- 2010年
- 用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。
- 冉旭华李树东闻晓波王密杨焕民倪宏波侯喜林朴范泽邵磊李晓娟李冬野周恩民
- 关键词：猪圆环病毒2型ORF3基因原核表达
