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诱导细胞mtDNA缺失以及再转入线粒体后对肿瘤细胞凋亡的影响被引量：5: 2009年; 目的对比研究mtDNA缺失以及再转入线粒体后细胞凋亡的变化。方法在成功构建ρ0SK-Hep1细胞和转线粒体细胞SK-Hep1 Cyb的基础上,采用Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(ΔΨm);Western blot检测细胞Bcl-2、Bax表达水平;免疫荧光染色观测Bcl-2细胞内分布。结果SK-Hep1、ρ0SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞凋亡率分别为(2.01±0.11)%、(0.37±0.08)%和(2.10±0.12)%。ρ0SK-Hep1对细胞凋亡有明显抗性(P<0.05)。ρ0SK-Hep1细胞内DCFDA荧光强度较SK-Hep1细胞显著增强(35.5与15.9,P<0.01);转入线粒体后,SK-Hep1Cyb细胞DCFDA荧光强度较ρ0SK-Hep1细胞明显下降(17.4与35.5,P<0.01)。ρ0SK-Hep1细胞MitoTracker Red荧光强度较SK-Hep1细胞显著减低(55.0与65.9,P<0.05);转入线粒体后,SK-Hep1Cyb细胞MitoTrack-er Red荧光强度与SK-Hep1细胞基本一致(67.4与65.9,P>0.05)。ρ0SK-Hep1细胞线粒体Bcl-2、Bax表达增多,Bcl-2/Bax比值增加(P<0.01)。SK-Hep1Cyb细胞线粒体Bcl-2/Bax值下降。结论mtDNA缺失肿瘤细胞对细胞凋亡有明显拮抗。Bcl-2线粒体转位、线粒体Bcl-2/Bax值增加、ROS产生增多可能参与细胞凋亡拮抗的形成。; 李歆强凌贤龙周源何玉琦李诗伟晏斌; 关键词：线粒体DNA ROS 细胞凋亡肿瘤

线粒体DNA损伤与人肝癌细胞多药耐药关系的研究被引量：4: 2009年; 目的:建立线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)缺失肝癌SK-Hep1细胞(ρ°SK-Hep1)的转线粒体模型(cybrid,Cyb),探讨mtDNA缺失诱导人肝癌细胞多药耐药表型产生的可能机制。方法:采用聚乙二醇融合法,将正常人血小板融合入ρ°SK-Hep1细胞,建立ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb,并采用PCR、Southern杂交进行鉴定;计数法描绘细胞生长曲线,计算倍增时间;Transwell实验检测细胞侵袭能力,MTT法检测药物敏感性,Western印迹法检测细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)和Bcl-2的表达水平。结果:PCR、Southern杂交证实ρ°SK-Hep1融合了正常人血小板线粒体,成功建立了转线粒体细胞模型SK-Hep1Cyb。ρ°SK-Hep1细胞群体倍增时间明显缩短(P<0.01),生长速度加快,侵袭能力增强;与SK-Hep1细胞和SK-Hep1Cyb细胞相比,ρ°SK-Hep1细胞对化疗药物耐药性增强,细胞内P-gp、MRP1和Bcl-2蛋白表达增加。结论:采用细胞融合技术成功建立了ρ°SK-Hep1细胞的转线粒体模型。P-gp、MRP1和Bcl-2蛋白表达增加在mtDNA缺失诱导多药耐药表型产生中可能具有一定的作用。; 何玉琦凌贤龙于金秋李诗伟周源李歆强晏斌; 关键词：肝肿瘤 DNA 线粒体多药耐药相关蛋白质类

细胞融合法转线粒体细胞模型的构建及鉴定: 2009年; 目的探讨细胞融合方法建立转线粒体细胞(cybrid)可行性,并对融合后细胞内mtDNA进行鉴定。方法采用细胞融合方法将正常人血小板与mtDNA缺失人肝癌细胞(ρ°SK-Hep1)融合,建立转线粒体细胞(SK-Hep1 Cyb),恢复细胞正常线粒体功能。并用PCR、Southern杂交、Western杂交及线粒体膜电位检测进行鉴定。结果PCR、Southern杂交、Western杂交及线粒体染色证实成功建立了ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb。结论采用细胞融合法可以建立转线粒体细胞,融合细胞恢复线粒体功能,转线粒体细胞可稳定存活30d以上。; 何玉琦乌秀敏凌贤龙周源李诗伟李歆强晏斌; 关键词：线粒体DNA 融合细胞肝癌

细胞线粒体DNA缺失鉴定的Southern杂交方法的建立被引量：1: 2010年; 目的建立一种简便、快捷、准确检测细胞线粒体DNA缺失的方法。方法将线粒体DNA所编码呼吸链中细胞色素氧化酶(COX)的亚单位COXⅠ和COXⅡ分别作为Southern杂交的分子探针,鉴别细胞株的线粒体DNA是否完全缺失。进行生长营养缺陷鉴定,并从RNA及蛋白水平对结果进行验证。结果 Southern杂交显示,SK-Hep1细胞可见COXⅠ、COXⅡ杂交条带,ρ°SK-Hep1细胞(线粒体缺失细胞)未见杂交条带形成,作为对比试验的生长营养缺陷法、PCR、Northern杂交和Western杂交,所得结果与Southern杂交结果一致。结论成功建立了鉴定细胞线粒体DNA缺失的Southern杂交方法,该方法能简便、快捷、准确地鉴定细胞线粒体DNA缺失。; 何玉琦凌贤龙张国桥李诗伟乐湘华晏斌周源李歆强; 关键词：DNA 线粒体印迹法 DNA 基因缺失

调控线粒体通透转运孔道对人肝癌耐药细胞SK-Hep1/CDDP多药耐药的影响: 2010年; 采用大剂量冲击、间歇诱导法获得人肝癌顺铂(cisplatin,CDDP)多药耐药细胞系SK-Hep1/CDDP。利用线粒体通透转运孔道(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放剂苍术苷(atractyloside,ATR)和抑制剂环孢素A(cyclosporin,CsA)分别干预SK-Hep1和SK-Hep1/CDDP细胞;免疫印迹法检测多药耐药基因Mdr-1和Bax表达水平;采用Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡率;采用荧光探针JC-1检测线粒体膜电位△Ψm的变化。探讨调控线粒体mPTP对人肝癌耐药细胞SK-Hep1/CDDP多药耐药的影响。结果提示,ATR可促进mPTP开放,加速△Ψm下降,同时降低Bax活性,增加SK-Hep1/CDDP细胞凋亡;CsA抑制mPTP开放,可减轻并延迟线粒体膜电位下降,使多药耐药细胞SK-Hep1/CDDP对CDDP诱导凋亡的耐受能力提高,同时增加Bax活性。但mPTP活性的变化对细胞Mdr-1蛋白表达水平无影响。mPTP的激活可能成为增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性及逆转肿瘤细胞多药耐药的新方法。; 周源凌贤龙李诗伟晏斌文蕾; 关键词：肝癌多药耐药线粒体膜电位

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李诗伟