周家喜
- 作品数：8 被引量：18H指数：2
- 供职机构：北京协和医学院血液病医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划天津市应用基础与前沿技术研究计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 利用CRISPR/Cas9技术建立诱导性敲除MEIS1基因的HEK293T细胞株
- 2016年
- CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,命名为293T-i Cas9。MEIS1(myeloid ectropic viral integration site 1)是TALE(three amino acid loop extension)同源域家族的转录因子,其在白血病发生发展、胚胎造血系统发育及神经系统发育中有重要作用,但其作用机制仍未完全明确。将靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表达载体转入293T-iCas9,SURVEYOR实验和Western blot检测结果表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。最终经测序和Western blot结果证明,成功建立了MEIS1敲除细胞株,这为研究MEIS1的功能提供了重要的工具。
- 张明智王梦鸽王洪涛苏培刘鑫张磊升刘翠翠王钰吴丹周家喜彭莎
- 关键词：基因敲除
- 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系被引量：11
- 2015年
- CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。MEIS2属于一类高度保守的同源盒转录因子MEIS家族,研究发现,MEIS2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对MEIS2基因作用的功能域,设计两个靶向MEIS2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认MEIS2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除MEIS2的HEK293T细胞株,为研究MEIS2的功能和作用机制提供了有效工具。
- 卢利莎白杨刘鑫王洪涛高洁杨亦青苏培刘翠翠王钰张磊升熊涛周家喜
- 关键词：基因敲除
- 人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞高效定向诱导分化模型的建立被引量：1
- 2015年
- 目的建立从人胚胎干细胞向成熟嗜酸性粒细胞定向诱导分化的高效体外培养模型。方法采用人胚胎干细胞与小鼠主动脉-性腺-中肾(m AGM)基质细胞共培养的方法,进行早期造血干细胞诱导分化,将诱导分化的造血干细胞进行悬浮培养,在含有血清的培养基中,分阶段添加不同细胞因子组合进行成熟嗜酸性粒细胞的定向分化和增殖。结果获得从CD34+CD45+细胞扩增了约651倍,且纯度高达95%以上,CD88+Siglec-8+EPO+的成熟嗜酸性粒细胞。结论本研究建立了1种人胚胎干细胞高效定向分化为成熟嗜酸性粒细胞的模型,为进一步深入研究嗜酸性粒细胞的早期发育调控和相关疾病的发生机制奠定了基础。
- 潘旭杨文钰孙文翠毛斌郁金凤路旭琳黄淑赖默温周涯邹庆李晴曾宪波周家喜马峰
- 关键词：人胚胎干细胞嗜酸性粒细胞定向诱导分化
- 人胚胎干细胞高效诱导产生巨噬细胞方法的建立被引量：5
- 2015年
- 目的利用人胚胎干细胞(h ESCs)建立高效巨噬细胞体外诱导分化体系,并与人脐带血CD34+细胞来源的巨噬细胞进行比较。方法通过将h ESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾(m AGM)来源的基质细胞共培养产生CD34+CD45+造血干祖细胞,在多种细胞因子的诱导下悬浮培养14 d,利用May-Grünwald Giemsa染色、流式表面抗原及功能检测等方法对我们培养的巨噬细胞和人脐带血CD34+细胞来源的巨噬细胞进行比较鉴定。结果该方法可产生大量高纯度的巨噬细胞,成功的建立了体外高效诱导的巨噬细胞分化体系,并且该体系获得的巨噬细胞与人脐带血CD34+细胞来源的巨噬细胞具有相似的表型和功能。结论建立高效巨噬细胞体外诱导分化体系,为进一步研究人类巨噬细胞的早期发育和建立相关疾病模型提供了可靠的方法。
- 郁金凤孙文翠路旭琳边国慧潘旭毛斌黄淑赖默温周涯邹庆李晴曾宪波李玉佳陈利民周家喜马峰
- 关键词：巨噬细胞诱导分化
- 拟胚体培养体系中造血表面标志的变化及其向红细胞分化潜能的研究被引量：1
- 2015年
- 目的探讨拟胚体(EB)造血相关表面标志物的变化及其向红细胞定向诱导分化的潜能。方法利用悬浮培养体系使人胚胎干细胞(h ESCs)形成三维囊状结构(EB),通过添加细胞因子BMP-4、SCF和FL使EB向造血前体细胞分化,通过流式细胞术(FACs)检测细胞发育各个阶段内皮及血细胞表面分子的变化情况以判断细胞的不同发育阶段。采用胰酶消化处理的方式将EB消化为单个细胞并向红细胞诱导分化,在诱导的d7、d14、d21取样,流式检测分析红细胞的成熟程度。结果在EB培养体系中,d6即可检测到造血前体细胞表面标志物CD34和CD31,且在EB培养的d6-d21,CD34+CD31+细胞的比例逐渐升高,到d15达到顶峰(8.86%)。在红细胞定向分化过程中,红细胞的纯度达73.22%,免疫荧光染色显示:ε亚基的阳性率为88%(424/482),γ亚基的阳性率为94%(326/347),而β亚基的阳性率为0%(0/167)。结论建立了1种EB悬浮培养体系和体外诱导红细胞的方法;EB的造血相关表面标志物的表达呈现时序性变化,且由EB分化而来的红细胞具有早期胚胎红细胞的发育特点。
- 路旭琳郁金凤孙文翠毛斌邹庆潘旭赖默温周涯李晴曾宪波黄淑周琼秀周家喜马峰
- 关键词：红细胞
- ERK信号通路在人胚胎干细胞造血分化中的作用研究被引量：2
- 2017年
- 细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)信号通路在斑马鱼及小鼠造血发生中发挥着重要作用,但其在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)造血分化中的作用尚不清楚。该研究利用h ESCs单层造血分化模型及ERK信号通路抑制剂PD98059探索了ERK信号通路在h ESCs造血分化中的作用。采用免疫荧光技术、流式细胞术分析发现,PD98059能够显著抑制CD43^+造血干/祖细胞的产生。进一步的研究发现,PD98059的作用阶段为APLNR+侧板中胚层产生阶段,在该作用阶段添加PD98059与造血分化全程添加对CD43^+造血干/祖细胞产生的抑制效果一致。该研究结果表明,抑制ERK信号通路通过抑制侧板中胚层细胞的产生而抑制h ESCs造血分化。该研究为建立体外h ESCs高效造血分化体系及规模化产生功能性血细胞奠定了理论基础。
- 王洪涛刘鑫王梦鸽苏培张磊升刘翠翠王钰吴丹涂茜周家喜
- 关键词：人胚胎干细胞造血分化ERK信号通路
- 一种高效的人胚胎干细胞早期造血分化和功能筛选模型的建立
- 2013年
- 人胚胎干细胞具有分化为造血前体细胞及各种功能血细胞的潜能.但是,目前的分化筛选模型定向诱导分化效率很低,分化程序复杂且较难建立,分化的细胞功能存在缺陷,这些严重影响了对人胚胎干细胞造血分化和功能成熟分子机理的了解.所以,迫切需要建立一种简单且方便进行基因操作的高效的造血分化和功能筛选模型,用于揭示分化过程中动态的分子信号和实时调控机理.本研究中,采用分步法在不依赖血清及基质细胞的条件下,建立了一种高效分化产生造血前体细胞的方法,CD34+CD31+造血前体细胞的比例可达到25%.产生的造血前体细胞可以进一步诱导分化为红系、粒系及粒-巨噬系集落.此外,携带针对T基因干扰shRNA的慢病毒可高效感染人胚胎干细胞,实现高效干扰,调控造血分化效率.本研究建立了一种高效分化产生造血前体细胞的方法,同时表明此模型可以有效与shRNA文库结合,筛选调控人胚胎干细胞造血分化的关键基因,为揭示人胚胎干细胞造血分化机理,以及设计更加完善的分化体系高效获得功能成熟的血细胞用于药物筛选及细胞治疗打下了基础.
- 庞素蕾吴清清田莎苏培白杨高洁杨亦青刘鑫朱正茂许元富周家喜
- 关键词：人胚胎干细胞造血分化
- DMSO促进人胚胎干细胞体外造血分化
- 2017年
- 目的:探讨DMSO在人胚胎干细胞造血分化中的作用。方法:利用已建立的人胚胎干细胞逐级诱导分化体系,通过流式细胞术分析并结合免疫荧光测定研究DMSO在造血分化中的作用,同时通过在不同时间点添加DMSO,确定其发挥作用的窗口期。结果:免疫荧光及流式细胞术分析发现,在人胚胎干细胞造血分化过程中添加DMSO显著促进CD43^+造血祖细胞的产生;流式细胞术分析发现,DMSO显著促进APLNR+侧板中胚层细胞和CD31^+CD34^+生血内皮细胞的产生;在侧板中胚层细胞产生的窗口添加DMSO显著促进CD31^+CD34^+生血内皮细胞和CD43^+造血祖细胞的产生。结论:DMSO通过促进侧板中胚层的产生促进人胚胎干细胞造血分化能力,在侧板中胚层发生窗口添加DMSO能够显著促进造血祖细胞的产生。
- 王洪涛王梦鸽刘鑫苏培张磊升刘翠翠王钰吴丹涂茜周家喜
- 关键词：人胚胎干细胞造血分化DMSO
