王丽娟
- 作品数：6 被引量：9H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市卫生局科研项目重庆市卫生局自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- VP3和TRAIL基因共表达沙门菌载体对胃癌细胞生长作用的影响被引量：1
- 2009年
- 目的:构建鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)VP3基因和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apopto-sis-inducing ligand,TRAIL)基因的真核表达载体,并观察其对胃癌细胞生长的影响情况。方法:采用分子克隆技术,将VP3基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建获得质粒pBud-TRAIL-VP3,采用电转化法将该重组质粒转入减毒沙门菌SL7207,再直接转染胃癌细胞株SGC-7901。48h后采用RT-PCR检测VP3基因表达状况并在荧光显微镜下观察细胞内有无绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达。MTT法检测重组菌株对SGC-7901细胞生长状况的影响。AO/EB荧光染色检测其对肿瘤细胞凋亡率的影响。透射电镜观察胃癌细胞形态改变。结果:获得VP3基因正确插入的真核表达载体;重组质粒经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后,RT-PCR检测到VP3基因存在;荧光显微镜下观察到在转染细胞内有GFP表达;转染48h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有明显抑制作用(P<0.05),荧光染色可见胃癌细胞有凋亡现象,pBud-TRAIL-VP3能够明显提高胃癌细胞的凋亡率(P<0.05),透射电镜观察到转染细胞发生凋亡形态变化。结论:减毒沙门菌可将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞并进行表达,TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长起协同抑制作用并能促进胃癌细胞的凋亡。
- 曹红丹向廷秀吕琳刘少宁王丽娟王丕龙
- 关键词：减毒沙门菌
- 真核表达载体pEGFP-N1-VP3的构建及在SGC-7901细胞中的表达和定位被引量：2
- 2009年
- 构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3并稳定转染人胃癌细胞SGC-7901,观察EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中的分布和亚细胞定位,探讨凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制。用PCR技术扩增出(凋亡素)VP3基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-VP3经脂质体介导转染SGC-7901细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察凋亡素在肿瘤细胞中的分布、亚细胞定位。用AO/EB荧光染色法检测其在体外诱导肿瘤细胞凋亡的效应。经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入载体pEGFP-N1,稳定转染细胞中EGFP-VP3在肿瘤细胞中得以高表达,转染后逐渐从细胞质迁移至细胞核,最后定位于细胞核内。AO/EB荧光染色观察到大量细胞凋亡。成功构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3,并成功培养出表达绿色荧光蛋白和凋亡素的SGC-7901稳定细胞株。EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中具有核定位效应,并诱导肿瘤细胞凋亡。
- 刘少宁祖毅向廷秀王丕龙王丽娟曹红丹吕琳
- 关键词：凋亡素融合蛋白真核表达胃癌细胞
- 减毒沙门菌介导的TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长抑制作用及其机制
- 2008年
- 目的:利用沙门菌作为真核质粒携带载体,在体内外观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和鸡贫血病毒VP3基因对胃癌细胞的生长抑制作用。方法:将重组质粒pBud-TRAIL、pBud-VP3、pBud-TRAIL-VP3电转化减毒沙门菌SL7207,经稳定性鉴定后直接转染胃癌细胞株SGC-7901,24h后利用荧光显微镜观察有无融合绿色荧光蛋白表达,MTT法检测表达载体对胃癌细胞的生长作用,流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期变化,并用免疫组织化学方法检测该载体对胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9表达的影响。荷瘤小鼠口服携带重组质粒的减毒沙门菌,8周后通过RT-PCR检测肿瘤组织内真核载体的表达状况,并测量荷瘤瘤体大小。结果:重组质粒能够在减毒沙门菌中稳定存在,经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后能够较好的表达,转染48h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有抑制作用,流式细胞仪观察到pBud-TRAIL-VP3能使胃癌细胞的凋亡率明显增高,TRAIL和VP3能够协同促进胃癌细胞Caspase-3、Caspase-9的表达。体内实验提示pBud-TRAIL-VP3沙门菌载体能够在肿瘤组织中表达并能抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论:减毒沙门菌将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞后,体内外实验证实该载体对胃癌细胞的生长起明显抑制作用,TRAIL和VP3联合作用机制与促进Caspase-3、Caspase-9的表达有关。
- 曹红丹吕琳向廷秀刘少宁王丽娟王丕龙
- 关键词：减毒沙门菌TRAIL基因VP3基因
- 表达VP3重组减毒沙门氏菌的构建和融合蛋白纯化
- 2008年
- 寻求有效的肿瘤基因疗法,构建鸡贫血病毒VP3的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,并获得较纯的表达VP3基因的融合蛋白,初步研究其免疫原性。采用PCR技术扩增VP3基因,并将其与原核载体pET32α(+)重组。将重组后质粒转染E.coliBL21,得到表达VP3的融合蛋白,并将此蛋白通过50%的Ni+-NTA亲和树脂纯化。同时将重组质粒转染减毒沙门氏菌SL7207。经双酶切和PCR鉴定,成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗。融合蛋白通过50%的Ni+-NTA亲和树脂纯化,得到纯度在90%以上的纯化蛋白。成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗,并且获得纯化的表达VP3的融合蛋白,为进一步研究VP3的免疫保护作用及对抗肿瘤疫苗的研制打下基础。
- 王丽娟刘少宁向廷秀王丕龙
- 关键词：凋亡素减毒沙门氏菌融合蛋白纯化
- 人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达被引量：2
- 2009年
- 目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。
- 吕琳曹红丹曾瀚庆王丕龙王丽娟刘少宁向廷秀
- 关键词：幽门螺杆菌耻垢分枝杆菌
- 分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的ApaⅠ位点与SnaBⅠ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis)mc2155中的表达情况。结果从BCG基因组中扩增出160bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致。测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M.smegmatis中成功表达。结论成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70。
- 吕琳曹红丹王丕龙刘少宁王丽娟向廷秀
- 关键词：结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子基因表达
